中度嗜鹽菌Halobacillus Y5的生物學特性研究

王艷紅++鄭小亮++曹寧++賈桂燕++岳才軍

摘 要：該文對中度嗜鹽菌Halobacillus Y5的生物學特性進行了研究。結果表明：Halobacillus Y5菌株的最佳生長溫度為30℃，生長較佳的酸堿度范圍為7.0～9.0，NaCl耐受范圍為3%～15%（w/v），最適濃度為9%（w/v）；營養條件方面，該菌生長的最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨。

關鍵詞：中度嗜鹽菌；Halobacillus；生物學特性

中圖分類號 Q939.96 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）04-0019-03

Study on Biological Characteristics of Halobacillus Y5

Wang Yanhong1，2 et al.

（1 Life Science and Technology College of Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，China； 2 College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China）

Abstract：The biological characteristics of Halobacillus Y5 was studied.The results showed that the optimal temperature was 30℃ and pH 7.0～9.0.The tolerance range of NaCl was 3%～15% （w/v），and the optimal concentration was 9% （w/v）.The optimal carbon source for Halobacillus Y5 was sucrose，the optimal nitrogen source was peptone.

Key words：Moderately halophilic bacteria； Halobacillus；Biological characteristics

喜鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus）屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae），由Spring等于1996年創立[1]，它們分離自鹽湖、鹽土、海洋太陽能鹽場等高鹽環境中。Halobacillus Y5是分離自松嫩平原蘇打鹽堿地的一株喜鹽芽孢桿菌，由于近年來的過度開荒和放牧，使得松嫩平原周邊地區的生態環境遭到嚴重破壞，也加速了松嫩平原中部土地的堿化率。因此，本實驗室對從松嫩平原鹽堿地分離到的Halobacillus Y5進行了生物學特性研究，旨在為該菌的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗所用菌株中度嗜鹽菌Halobacillus Y5為本實驗室分離純化[2]并保存。

1.1.2 培養基 改進的S-G培養基[3]：Tryptone，10g/L；Yeast extract，5g/L；Casein，5g/L；KCl，2g/L；Sodium citrate，3g/L；MgSO4·7H2O，20g/L；Distilled water，1 000mL。pH值調至7.2～7.4。LB培養基：Tryptone，10.0g/L；Yeast extract，5.0g/L；NaCl，10.0g/L。pH值調至7.0。

1.1.3 供試碳源、氮源 所用碳源包括：D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇、醋酸鹽、D-纖維二糖，共15種。所用氮源包括：L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-甲硫氨酸、硝酸銨、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、牛肉膏，共11種。

1.2 方法

1.2.1 Halobacillus Y5的NaCl生長濃度 菌株在0、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%和20%（w/v）的NaCl LB液體培養基中，按照1%的接種量接入種子菌液，28℃振蕩培養48h后，測定OD600確定最適NaCl生長濃度。每個處理重復3次。

1.2.2 Halobacillus Y5的生長溫度范圍 在最適NaCl生長濃度的S-G培養液中，按照1%的接種量接入種子液，分別在4、10、28、30、32、35、37、40、50℃下培養，測定菌株的最適生長溫度及范圍。每個處理重復3次。

1.2.3 Halobacillus Y5的最適生長pH和范圍 在已確定的菌株最適生長NaCl濃度的S-G培養液中，按照1%的接種量接入pH梯度培養基中。pH梯度為：3、4、5、6、7、8、9、10和11，pH3～6使用0.1M乙酸緩沖液調節，pH7～9使用0.1MTris-HCl緩沖液調節，pH10～11使用0.05M碳酸氫鉀緩沖液調節，并于最適溫度下培養。每個處理重復3次。

1.2.4 不同碳源對Halobacillus Y5的影響 將基礎培養基中的碳源葡萄糖替換為等量的其他碳源：蔗糖、D-纖維二糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇、醋酸鹽，以不加任何碳源的作為對照，其他條件不變，按照1%（v/v）接種量接入培養基，觀察Halobacillus Y5的生長狀況。每個處理重復3次。

1.2.5 不同氮源對Halobacillus Y5的影響 將基礎培養基中的氮源硝酸銨替換為等量的其他氮源：L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-甲硫氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、牛肉膏，以不加任何氮源的作為對照，其他條件不變，按照1%（v/v）接種量接入培養基，觀察Halobacillus Y5的生長狀況。每個處理重復3次。

1.2.6 數據統計與分析 用GraphPad Prism 6.01軟件分析鹽度、pH值、溫度、不同碳源、氮源對Halobacillus Y5的生長影響并作圖。

2 結果與分析

2.1 Halobacillus Y5的NaCl生長濃度 由圖1可知，Halobacillus Y5在LB培養基中的NaCl耐受范圍較廣，在0%～20%（w/v）濃度下均能生長，在3%～15%（w/v）生長較好，最適NaCl濃度為9%。因此，該菌株的鹽度耐受范圍較廣。

2.2 Halobacillus Y5的生長溫度范圍 由圖2可知，Halobacillus Y5在S-G培養基中能夠在4～50℃的溫度范圍內生長，在28～37℃生長較快，最佳生長溫度為30℃。因此，該菌株具有一定的溫度耐受性。

2.3 Halobacillus Y5的最適生長pH和范圍 由圖3可知，Halobacillus Y5在pH5.0～10.0范圍內，均有不同程度的生長，但在pH 7.0～9.0范圍其生長較好，pH 8.0生長最佳。因此，pH 8.0為其生長最適pH。

2.4 不同碳源對Halobacillus Y5的影響 將基礎培養基中的碳源葡萄糖替換為等量的其他碳源后，發現菌株Halobacillus Y5能夠利用蔗糖、醋酸鹽、D-纖維二糖、D-棉子糖、L-鼠李糖，其中以蔗糖作為唯一碳源時長勢最佳，不能利用麥芽糖、D-果糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、乳糖、D-木糖、乙醇、丙三醇、D-甘露醇（表1），可見，該菌對多種碳源都能利用，需求不嚴格。

2.5 不同氮源對Halobacillus Y5的影響 將基礎培養基中的氮源硝酸銨替換為等量的其他氮源后，發現菌株Halobacillus Y5能夠利用L-丙氨酸、L-組氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、牛肉膏，其中以蛋白胨作為唯一氮源時生長最佳，不能利用L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸（表2）。

3 結論與討論

研究結果表明，鹽度、溫度、酸堿度及營養條件等對Halobacillus Y5生長具有一定的影響。該菌最適NaCl濃度9%、最適溫度30℃，相比其他pH而言，pH 8.0下生長最佳。Halobacillus Y5可以不同程度地利用多種碳源和氮源，碳源是微生物生長的一類營養物，根據微生物所能產生的酶系的不同，不同的微生物可利用不同的碳源，提供細胞生命活動所需的能量，在碳源利用上，以蔗糖效果最佳；氮源是可以被微生物用來構成細胞物質或代謝產物中氮素來源的營養物質，常被微生物用來合成細胞中含氮物質，微生物對氮源的利用具有選擇性[4，5]，本實驗在氮源利用上以蛋白胨效果最佳。

本實驗通過對中度嗜鹽菌Halobacillus Y5生物學特性的研究，明確了該菌的生長環境條件，為該菌的的深入研究奠定基礎，也為鹽堿地的開發利用以及耐鹽堿基因的篩選及克隆提供理論支持。

參考文獻

[1]Spring S，Ludwig W，Marquez M C，et al.Halobacillus gen.nov.，with descriptions of Halobacillus litoralis sp.nov.and Halobacillus trueperi sp.nov.，and transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb.nov[J].Int J Syst Bacteriol，1996，46：492-496.

[2]方中達.植病研究方法[M].第3版.北京：中國農業出版社，1998.

[3]SEHGAL S N，GIBBONS N E.Effect of some metal ions on the growth of Halobacterium cutirubrum[J].canadian journal of microbiology，1960，6： 165-169.

[4]閆征.南召縣土地利用碳源碳匯及其變化分析[D].鄭州：河南大學，2012.

[5]王端好.高活力山梨醇脫氫酶氧化葡萄糖酸桿菌選育及生物催化合成米格列醇的研究[D].西安：西北大學，2010.