基于大鼠鼻腔灌流法篩選芍藥苷經鼻給藥制劑的吸收促進劑

朱智濤+潘金火+吳賢慧+蔣志濤

[摘要]該實驗篩選了芍藥苷經鼻給藥制劑的吸收促進劑，建立了HPLC測定灌流液中芍藥苷的方法，采用改良的大鼠鼻腔灌流模型，篩選吸收促進劑的種類和用量。為了避免鼻腔的分泌和吸收對灌流液體積的影響，采用體積校正法計算剩余藥量，各時間點剩余藥量的百分率取對數后與對應時間進行回歸，回歸直線的斜率即為吸收速度常數。結果顯示，羥丙基-β-環糊精和水溶性氮酮能夠顯著提高芍藥苷的鼻腔吸收，其中水溶性氮酮吸收速度常數最大，對芍藥苷的促滲效果最好。當灌流液中水溶性氮酮的質量濃度由5 g·L^-1逐漸升高為20 g·L^-1時，吸收速度常數逐漸變大，20 g·L^-1時達到峰值；當其質量濃度增加至30 g·L^-1時，吸收速度常數變小，表明水溶性氮酮質量濃度為20 g·L^-1時促滲效果最好。

[關鍵詞]芍藥苷； 大鼠鼻腔灌流； 吸收促進劑； 水溶性氮酮

[Abstract]This experiment was aimed to screen the absorption enhancer for intranasal administration preparations of paeoniflorin. In this study， HPLC method for determination of paeoniflorin in perfusion liquid was established and the improved model of nasal perfusion in rats was used to screen out the species and amounts of absorption enhancer. In order to avoid the influence of the secretion and absorption of nasal cavity on the volume of perfusion fluid， the residual dose was calculated by using the volume correction method. Linear regression was carried out between the logarithm to the percentage of the residual dose and the corresponding time， and the slope of the regression line was exactly the absorption rate constant. Experimental results showed that hydroxypropyl-β-cyclodextrin and water-soluble azone can significantly improve the nasal absorption of paeoniflorin. Furthermore， water-soluble azone had the highest absorption rate constant and the best promoting penetration effect on intranasal administration preparations of paeoniflorin. It was also found that when the mass concentration of water-soluble azone in the perfusion liquid increased from 5 g·L^-1 to 20 g·L^-1， the absorption rate constant was gradually increased and peaked at 20 g·L^-1. When the mass concentration was increased to 30 g·L^-1， the absorption rate constant was decreased， indicating that the best mass concentration of water-soluble azone was 20 g·L^-1.

[Key words]paeoniflorin； nasal perfusion in rats； absorption enhancer； water-soluble azone

芍藥苷（paeoniflorin）是一種主要存在于毛茛科多年生宿根草本植物芍藥Paeonia albiflora Pall.的根中的單萜類糖苷化合物，具有顯著的鎮痛、鎮靜、抗驚厥作用。此外，芍藥苷還具有降溫解熱、抗炎、抗潰瘍、抗氧化、抗凝血及調節血脂等作用^[1]。近年來隨著研究的深入，發現芍藥苷亦可作用于神經系統，對老年癡呆、帕金森病和腦缺血損傷都有一定的治療作用，但是芍藥苷經口服進入人體后生物利用度較低，不利于發揮藥效^[2-5]。

研究表明存在著基于鼻腔到達中樞神經系統的通路，經鼻給藥可繞過血腦屏障直接進入中樞神經系統，更好地發揮芍藥苷在中樞的治療作用^[6]。芍藥苷水溶性較大，不易被鼻黏膜吸收，通過添加吸收促進劑可以增加芍藥苷對鼻黏膜的穿透作用。本研究通過大鼠鼻腔灌流法比較羥丙基-β-環糊精、丙二醇、水溶性氮酮對芍藥苷的促滲作用，篩選出吸收促進劑的種類和較佳用量，為今后芍藥苷經鼻給藥制劑的研究提供實驗依據^[7]。

1 材料

Waters 2695高效液相色譜儀（沃特世公司），Waters 2998紫外檢測器（沃特世公司），MS105DU電子分析天平（瑞士梅特勒公司），AY220電子分析天平（日本島津），TGL-16C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器有限公司），BT100-2J蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

芍藥苷（純度>90%，批號ZL1603021-SYG，南京澤朗生物科技有限公司），芍藥苷對照品（供含量測定用，批號110736-201136，中國食品藥品檢定研究院），2-羥丙基-β-環糊精（批號20151111，國藥集團化學試劑有限公司），水溶性氮酮（廣州詩茗化工有限公司），丙二醇（分析純，批號20141110，廣東光華科技股份有限公司），磷酸二氫鉀（色譜級，批號13121612226，南京化學試劑有限公司），甲醇（色譜純，批號20160730066，山東禹王實業有限公司化工分公司），純凈水（杭州娃哈哈集團）。

SD大鼠，雄性，體重（230±20）g，上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0006。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Hanbon C18 Hedera ODS-2色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相甲醇-0.05 mol·L^-1磷酸二氫鉀溶液（32∶68），檢測波長230 nm，流速1.0 mL·min^-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。該條件下，系統適應性良好，見圖1。

2.1.2 線性關系考察 精密稱定芍藥苷對照品14.55 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得582.00 mg·L^-1的母液。精密量取一定量的對照品母液，用甲醇分別稀釋為17.46，34.92，46.56，58.20，69.84，93.12 mg·L^-1對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件進行測定，以芍藥苷質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行回歸，標準曲線方程為y=15 018x-15 165，r=0.999 9，表明芍藥苷在17.46～93.12 mg·L^-1與峰面積線性關系良好。

2.1.3 精密度考察 精密吸取質量濃度為58.20 mg·L^-1的對照品溶液，重復進樣測定6 次，測定峰面積的RSD為0.46%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩定性考察 以空白鼻灌流液配制質量濃度為50 mg·L^-1的芍藥苷溶液，在37 ℃恒溫水浴中平衡，分別于0，2，4，6，8，12 h時12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清進樣測定峰面積，RSD為0.23%，表明鼻灌流液中芍藥苷的穩定性良好。

2.1.5 重復性考察 以空白鼻灌流液配制6份質量濃度為50 mg·L^-1的芍藥苷溶液，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清進樣測定峰面積。芍藥苷的RSD為1.4%，表明重復性良好。

2.1.6 回收率實驗 分別于空白鼻灌流液中加入芍藥苷對照品適量，制成含芍藥苷分別為29.41，58.82，77.40 mg·L^-1的樣品溶液，各3份，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液進樣測定，平均回收率分別為為103.5%，98.37%，100.6%，RSD分別為1.2%，0.44%，2.3%。

2.2 大鼠在體鼻腔灌流實驗

2.2.1 灌流液的配制 精密稱取芍藥苷和吸收促進劑，加生理鹽水配制成50 mg·L^-1芍藥苷灌流液。

2.2.2 鼻腔灌流 選擇質量（230±20）g的SD雄性大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，仰臥，固定四肢于鼠板上進行手術，切開頸部皮膚暴露氣管和食管。于氣管后部切口插入聚乙烯管并結扎固定，以供大鼠正常呼吸。再取一根聚乙烯管通過食道前部切口插入直至鼻腔底部。將鼻腔至口腔的鼻腭通道用膠黏劑封閉，以防灌流液從鼻腔流入口腔之中。將插入食道的聚乙烯管暴露在外的一端與蠕動泵硅膠管連接，硅膠管另一端插入灌流液，依靠蠕動泵使灌流液通過鼻腔循環^[8]。

首先用生理鹽水循環 10 min，比較循環前后的生理鹽水體積，確定整個環路是否有漏液情況。排出生理鹽水，取7 mL循環液置于10 mL量筒中，放置于37 ℃恒溫水浴中加熱，插入硅膠管開啟蠕動泵，灌流液流速為2 mL·min^-1。待循環液從大鼠鼻孔中滴出開始計時，分別于0，10，20，30，45，60，90，120 min讀取量筒中循環液體積V_N后取樣0.2 mL，補加循環液0.2 mL，樣品12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液進樣，測定各時間剩余藥物濃度C_N。其中循環死體積為V₀=（7-V₁）。剩余藥量Q_N采用體積校正法來計算。

式中Q_N為第N個時間點的剩余藥量（μg），（V_N+V₀）為第N個時間點時循環液的實際體積（mL），C_N為第N個取樣點測得的藥物質量濃度（mg·L^-1），C₀為補加的循環藥液的質量濃度（mg·L^-1）。

X=Q_N/Q₀

lnX=-Kt

通過不同時間點的剩余藥量Q_N計算出各時間點剩余藥量的百分率X，再取對數后與相對應時間t進行線性回歸，回歸直線的斜率即為吸收速度常數K，K的大小可反映芍藥苷通過鼻腔的吸收情況^[9-11]。

按2.2.1項下配制灌流液，置于量筒中，37 ℃恒溫水浴，將蠕動泵硅膠管插入灌流液中，進行體外空循環，于0，120 min取樣測定，兩時間點的芍藥苷質量濃度沒有變化。說明2 h內芍藥苷在循環管路中基本不吸附。

2.3 吸收促進劑種類考察

按2.2.1項下配制的4份灌流液，其中3份分別加入適量羥丙基-β-環糊精、丙二醇、水溶性氮酮，使制得的3份灌流液中吸收促進劑質量濃度為都為20 g·L^-1。按2.2.2項下方法進行試驗，結果見表1，圖2。

結果采用t檢驗分析差異，加入羥丙基-β-環糊精和水溶性氮酮后能夠顯著提高鼻腔的吸收（P<0.05），丙二醇對芍藥苷的鼻腔吸收無明顯影響，其中水溶性氮酮吸收速度常數K最大，對芍藥苷的促滲效果最好。

2.4 吸收促進劑用量考察

按2.2.1項下配制4份灌流液，分別加入不同質量濃度的水溶性氮酮。按2.2.2項下方法進行試驗，結果見表2，圖3。

結果顯示當灌流液中水溶性氮酮的質量濃度由5 g·L^-1逐漸升高為20 g·L^-1時，吸收速度常數K逐漸變大，對芍藥苷的促滲效果逐漸變強；當水溶性氮酮的質量濃度增加至30 g·L^-1時，吸收速度常數K有所變小，但與質量濃度為20 g·L^-1組相比，無顯著性差異，表明水溶性氮酮質量濃度為20 g·L^-1時促滲效果最好。

3 討論

芍藥苷可作用于神經系統，對帕金森病和老年癡呆等神經退行性疾病有良好的神經保護作用以及較小的毒副作用。芍藥苷口服利用度低，影響藥效發揮，鼻腔給藥則可使芍藥苷直接通過鼻腔嗅上皮的雙極嗅細胞沿嗅神經入腦，發揮中樞治療作用。芍藥苷的LogP<-0.3，為水溶性藥物，不易被鼻黏膜吸收，需要添加吸收促進劑，增加芍藥苷的吸收^[12]。前期實驗結果顯示，當灌流液中芍藥苷質量濃度為100，150，300 mg·L^-1時，經灌流后芍藥苷質量濃度無顯著變化，故灌流液中芍藥苷的質量濃度選擇50 mg·L^-1。大鼠鼻黏液的pH為5.5～7.0，在進行實驗時還需要考慮灌流液的pH對芍藥苷鼻腔灌流實驗的影響^[13]。經測定，2.3和2.4項下的8份灌流液pH都在5.5～7.0，不會對鼻黏膜產生刺激。

實驗結果顯示水溶性氮酮對芍藥苷的促滲效果優于其他吸收促進劑，當其質量濃度為20 g·L^-1時效果最好。芍藥苷為水溶性藥物，透過鼻黏膜的主要障礙在于磷脂雙分子層中的脂質成分。丙二醇作為滲透促進劑可以引起脂質移除，使得親水性孔道打開，藥物的透過量增加。但丙二醇單獨使用時促滲效果并不是很好，故而對芍藥苷的鼻腔吸收無明顯影響。羥丙基-β-環糊精則是通過直接作用于生物膜，使得藥物的滲透性增加，不存在藥物與脂質間的可逆性交換^[14]。水溶性氮酮的作用機制是作用于細胞的類脂質雙分子層，增加流動性，從而提高藥物的滲透性。水溶性氮酮質量濃度為20 g·L^-1時促滲效果好于30 g·L^-1時的促滲效果，提示水溶性氮酮的促滲效果與濃度相關，在一定濃度時有促滲峰值，低于或高于此濃度時，則促滲效果都會減弱。本實驗目的是篩選出一種適合芍藥苷經鼻給藥制劑的吸收促進劑，改善芍藥苷的鼻腔吸收，有關實驗顯示芍藥苷的吸收呈濃度依賴型增加，推測其在鼻腔中的吸收可能是被動擴散^[15]。本實驗篩選出水溶性氮酮作為吸收促進劑，其對水溶性藥物的促滲作用較強，毒性低、安全性高。同時還確定了水溶性氮酮的較佳用量，為今后芍藥苷經鼻給藥制劑的研究提供了實驗依據。

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[責任編輯 孔晶晶]