河北省不同地區杠柳遺傳多樣性的ISSR分析

狄魁穎++黃大莊++賈艷晶++張顯國++王偉++霍騰達

摘要：通過ISSR分子標記技術，對采自河北石家莊、保定、邢臺、邯鄲、張家口的11個杠柳（Periploca sepium Bunge）樣品進行遺傳多樣性分析。結果表明，從100條通用引物中共篩選出34條適用于杠柳ISSR研究的多態性引物；對11個供試樣品進行PCR檢測，進一步篩選出8條多態性好、穩定性高的引物，共檢測出79個ISSR位點，多態性位點63個，占79.7%；遺傳相似系數（GS）變化范圍在0.454 5～0.854 5，8對多態性引物多態信息含量值變化范圍為0.747～0.884，平均為0.827；11份供試樣品聚類分為三大類，聚類相對復雜，呈一定的地域相關性；ISSR分子標記適用于杠柳遺傳多樣性研究，且杠柳遺傳多樣性豐富。

關鍵詞：杠柳（Periploca sepium Bunge）；ISSR；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S326；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0570-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.046

Genetic Diversity Analysis of Periploca sepium Bunge in Hebei Province by ISSR Markers

DI Kui-ying1，HUANG Da-zhuang1，JIA Yan-jing1，ZHANG Xian-guo2，WANG Wei3，HUO Teng-da4

（1. College of Landscape and Travel，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Highway Administration Bureau of Hebei Province， Shijiazhuang 050000，China；3. Great Wall Motor Co.， Ltd.， Baoding 071000，Hebei，China；4. Luanping County Propaganda Department，Chengde 068250， Hebei，China）

Abstract：ISSR makers was used to analyze the genetic diversity of 11 Periploca sepium Bunge samples from Shijiazhuang， Handan， Xingtai， Zhangjiakou， Baoding. The results showed that 34 polymorphic primers were selected from 100 general primers for ISSR analysis. 11 samples were tested for PCR， and 8 primers with good polymorphism and stability were screened out， 79 ISSR loci were amplified by 8 primers， among which 63 loci were polymorphic， accounting for 79.7%. Genetic similarity coefficient varied in the range of 0.454 5～0.854 5. the change range of PIC values of polymorphic primers was 0.747～0.884， the average was 0.827. 11 samples were clustered into 3 groups， and the cluster was relatively complex， the accessions were significantly related to the geographical. ISSR molecular markers were applied to the study of genetic diversity of Periploca sepium Bunge， and the genetic diversity was rich.

Key words：Periploca sepium Bunge； ISSR； molecular markers； genetic diversity

杠柳（Periploca sepium Bunge）又叫北五加皮、桃枝子、羊奶子、羊角桃等，是蘿藦科杠柳屬植物。在河北全省均有分布，主要集中于太行山山區，道路兩旁以及田間荒坡，其根皮為傳統中藥材，有祛風濕、利水消腫、強筋骨的作用[1]，其特性為喜光、耐寒、耐旱、耐蔭、耐鹽堿。根系分布深，呈叢生狀態[2]。杠柳具有廣泛的適應性，是優良的固沙、水土保持樹種，不僅是優良的高速公路邊坡綠化樹種，同時也是煤矸石山生態恢復的可自然定居樹種[3]。近年來，隨著杠柳藥理作用不斷被開發，市場需求增加，出現過度采挖，而其種苗繁育遲緩，不利于進一步開展資源保護利用以及人工培植規劃[4]。目前，國內外對杠柳研究多集中于生理生態及藥理生態的研究，DNA分子水平研究鮮見報道。本研究利用ISSR分子標記方法對11個不同地區杠柳進行分析，篩選適用于杠柳ISSR分子標記的引物，并分析其遺傳多樣性，旨在為后續應用分子標記方法對杠柳進行相關研究以及杠柳種質資源的合理開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的11份杠柳種質資源，分別采自保定、石家莊、邯鄲、張家口、邢臺等地（表1），選擇當年萌發的新鮮葉片，低溫下洗凈、晾干，-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 杠柳基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取供試樣品DNA：取新鮮葉片1 g，加入適量液氮置于預冷的研缽中快速研磨，待葉片研磨成粉末，快速裝入預冷的2 mL離心管中，加入提前預熱的DNA提取液750 μL，充分振蕩混勻。將混勻后的離心管64.5 ℃熱水浴30 min，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，重復此步驟兩次。取上清液，加入等體積的預冷異丙醇放入-20 ℃冰箱中凍沉3 h。凍沉結束后，棄上清液，保留管底白色物質，70%乙醇清洗2次，無水乙醇清洗1次，放入烘箱烘干，加入50 μL ddH2O和1 μL RNA酶，冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱保存備用。

用NANODROP2000型超微量核酸儀檢測濃度和純度，質量濃度稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存用于ISSR分析。

1.3 引物篩選

擴增引物按照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR引物序列，由上海生物工程股份有限公司合成。隨機選取8個地區供試樣品進行ISSR引物的篩選，從中篩選出適用于杠柳ISSR研究的多態性引物，并進一步篩選多態性好、背景清晰、穩定性高的高效率引物。每個引物擴增程序重復2次，每條引物的變性溫度根據引物的Tm值設置12個梯度進行篩選[5]。具體引物序列以及退火溫度見表2。

1.4 ISSR-PCR擴增與產物檢測

1.4 1PCR擴增反應體系 ISSR-PCR擴增在BIO-RAD 公司生產BS97MyCycler型PCR儀上進行。ISSR反應體系：25 μL反應體系中含有12.5 μL的 Taq Master Mix，正向引物和反向引物各10 μL，50 ng模板DNA。

1.4.2 擴增反應程序 ISSR擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，52～62 ℃（每條引物不同，詳見表2）退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共40個循環，循環結束后72 ℃延伸10 min，擴增產物4 ℃保存。

1.4.3 擴增產物檢測 在1×TAE緩沖系統下，取10 μL擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上電泳分離，用DL2000 Marker作為標準分子量進行對照，穩定電壓170 V，經溴化乙錠（EB）染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.5 數據統計與分析

根據ISSR擴增產物條帶在瓊脂糖凝膠上的遷移率，對擴增條帶進行二元數據統計，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”，條帶弱的位點在重復擴增中穩定出現的記為“1”，建立“0”“1”原始數據矩陣。用NTSYS-pc 2.10e軟件進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR引物在杠柳上的通用性分析

以供試材料基因組DNA為模板，對100條ISSR通用引物進行篩選，擴增結果表明，43條能擴增出產物，其中9條無多態性，其余均呈現多態性（表2），通用性較低。圖1所示為引物UBC826擴增圖譜。34條多態性引物擴增共得到236條DNA條帶，其中多態性條帶194條，多態率82.2%。每對引物擴增條帶數量范圍在2～16條，平均為6.94條。擴增條帶最多的是UBC895，達16條，多態率也達最高為100%，擴增條帶較少的引物僅得到2條，如UBC817、UBC824、UBC840、UBC846、UBC853，但多態率均達100%，其中引物UBC866僅得到2條DNA條帶，并且多態率最低為50%。擴增DNA片段大小在100～2 000 bp，以500～1 000 bp居多。以上數據表明，ISSR分子標記檢測杠柳遺傳多樣性效率較高，同時說明杠柳種質資源具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 高效率ISSR引物篩選

對11份供試樣品進行ISSR-PCR擴增并檢測，進一步篩選出8條背景清晰、多態性好、穩定性高的引物進行后續遺傳多樣性研究（表3）。8對引物共得到79條條帶，多態性條帶63條，多態率達79.7%。以此可見，杠柳種質資源在分子水平上多態性豐富；擴增片段長度在100～2 000 bp之間，每條引物平均擴增條帶9.88條，PIC變幅為0.747～0.884，平均為0.827，說明8對引物均為高度多態性信息引物[6]，圖2為引物UBC818擴增圖譜。

2.3 親緣關系分析

利用NTSYS-pc 2.10e軟件計算供試材料間的遺傳相似系數，得到相似性矩陣（表4）。遺傳相似系數（GS）可以揭示不同地區種質間彼此遺傳關系遠近，11個不同地區供試樣品遺傳相似系數變化范圍在0.454 5～0.854 5，其中供試樣品6與9親緣關系最近，遺傳相似性系數高達0.854 5，供試樣品6與10親緣關系最遠，遺傳相似性系數僅為0.454 5。結果表明，不同地區杠柳種質資源遺傳差異明顯。

2.4 聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10e軟件對11份杠柳供試樣品進行UPGMA聚類分析，通過Tree plot模塊生成聚類分析樹狀圖（圖3）。從圖3可以看出，11個不同地區種質材料在相似系數為0.60水平上分為三大類，第Ⅰ類為來自石家莊贊皇、邢臺內丘、沙河、邯鄲涉縣和武安的樣品；在相似系數為0.70水平上，第Ⅰ類樣品中來自邯鄲涉縣的樣品與邢臺內丘和石家莊的樣品區別開來。第Ⅱ類共包括5份種質，分別來自于保定易縣、滿城、阜平、淶水、淶源。來自張家口的樣品作為單獨一支，為第Ⅲ類。由此可見，杠柳種質親緣關系與地理分布呈一定相關性，其生長區域越近親緣關系越近，充分體現了地域分布和環境對杠柳的影響。

3 小結與討論

物種的遺傳多樣性反映該物種適應環境的能力，遺傳多樣性越豐富，在不同生境存活的可能性越大[7]。ISSR分子標記具有較高的多態性和穩定性，無需預知物種DNA信息背景，操作簡單，廣泛應用于植物的遺傳多樣性研究[8]。本研究通過篩選得到8對高效ISSR引物，對11份地理來源不同的杠柳種質進行遺傳多樣性分析，共檢測到位點79個，多態率達79.7%，多態性較高，表明供試杠柳基因組DNA具有明顯的遺傳差異，多樣性豐富。ISSR分子標記是一種有效的用于杠柳種質資源遺傳多樣性研究的技術。尹海波等[9]利用ISSR技術對老鸛草遺傳多樣性進行分析，其多態率高達94.6%，趙雪英等[10]利用ISSR標記探討了33份綠豆種質資源的遺傳多樣性，多態率達98.18%。雖然本研究中引物多態率達到79.7%，但仍低于上述兩個研究，分析原因可能是物種的差異導致多態率的差異，多態性引物需要進一步篩選。

本研究對杠柳遺傳多樣性僅采用了ISSR技術，但高山等[11]利用RAPD和ISSR兩種分子標記對苦瓜種質資源的遺傳多樣性進行檢測，發現2種分子標記方法都能檢測其較高的遺傳多樣性，ISSR標記較RAPD標記多態性更高。王志清等[12]利用ISSR和SRAP標記分別對61份細辛資源進行遺傳多樣性分析，結果表明相同數量的引物，ISSR標記揭示的多態性高于SRAP標記。王惠梅等[13]分別應用SSR和ISSR對野生菰資源遺傳多樣性進行分析表明，SSR標記多態性比率較ISSR要高。因此，在以后的研究應進一步采用其他標記技術，篩選更適合杠柳的分子標記技術。

分子標記是研究物種遺傳多樣性的基礎工作之一，因研究材料和技術不同，研究結果不盡相同。本研究結果表明，不同地區杠柳的親緣關系與地域分布呈一定相關性，這與胡仲義等[14]對麥冬種質資源ISSR分析研究結果一致。任風鳴等[15]對金錢草種質的ISSR研究結果表明，通過ISSR標記的親緣關系聚類與地理分布不具有明顯的相關性。

從聚類分析可以看到，一方面，供試材料在聚類中按照緯度變化呈一定的地域相關性，反映地域隔離產生遺傳差異；另一方面，來自保定不同縣域的種質也產生了遺傳差異，充分體現表明杠柳多樣性豐富，進一步開發利用的空間較大。為更全面和真實地揭示杠柳的遺傳多樣性，更為合理利用、保護和管理杠柳種質資源，有必要采用多種技術手段、對更大范圍內杠柳種質進行研究和檢測其遺傳多樣性。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典一部[M].北京：化學工業出版社， 2005.

[2] 李文娟.杠柳繁殖技術及對土壤理化性質影響的的研究[D].河北農業大學，2013.

[3] 陳金成，張顯國.杠柳在高速公路綠化中的應用研究[J].公路交通科技，2010，72（12）：65-66.

[4] 李天祥，張春艷，李國輝，等.杠柳的生態生物學特性研究[J].現代藥物與臨床，2013，28（5）：730-733.

[5] 李隆云，陳大霞，鐘國躍，等.不同產地仙茅遺傳多樣性的ISSR分析[J].中草藥，2012，43（5）：967-970.

[6] BREDEMEIJER G，COOK R，GANAL M，et al. Construction and testing of microsatellite database containing more than 500 tomato varieties[J].Theoretical and Applied Genetics，2002，105：1019-1026.

[7] 王 翀，郭志剛，趙桂仿，等.利用ISSR分析6種絞股藍屬植物的遺傳多樣性與親緣關系[J].西北大學學報，2008，38（5）：767-770.

[8] 王建波.ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J].遺傳，2002，24（5）：613-616.

[9] 尹海波，王吉華，涂秀文，等.不同產地老鸛草遺傳多樣性ISSR分析[J].中草藥，2013，44（22）：3206-3211.

[10] 趙雪英，王宏民，李 赫，等.綠豆種質資源的ISSR遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報，2015，16（6）：1277-1282.

[11] 高 山，林碧英，許端祥，等.苦瓜種質遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J].植物遺傳資源學報，2010，11（1）：78-83.

[12] 王志清，劉繼永，李昌禹，等.利用ISSR和SRAP標記分析細辛資源遺傳多樣性與親緣關系[J].植物遺傳資源學報，2015，16（5）：1035-1044.

[13] 王惠梅，吳國林，江紹琳，等.基于SSR和ISSR的潘陽湖流域野生菰資源的遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報，2015， 16（1）：133-141.

[14] 胡仲義，吳 帆，徐兵兵，等.不同地區麥冬遺傳多樣性的ISSR分析[J].中國野生植物資源，2015，34（3）：23-26.

[15] 任風鳴，金江群，焦雁翔，等.中藥金錢草種質資源的ISSR遺傳多樣性研究[J].中國藥學雜志，2015，50（15）：1277-1281.