淀粉芽孢桿菌HAB—7對18株植物病原真菌的抑制作用

劉文波++秦春秀++熊燕紅++孫亮++林春花++繆衛國++鄭服叢

摘 要 HAB-7是一株分離自豇豆根際土壤、具有較強抑菌作用的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。研究HAB-7對18株植物病原真菌及其發酵液粗提蛋白對植物病原的抑制作用，并測定其對番茄種子的促生作用。采用平板對峙法測定其對18株植物病原真菌的抑制活性，以橡膠樹炭疽菌為指示菌，對其發酵上清液經60%、80%硫酸銨鹽析獲得的抗菌粗蛋白進行測試；并將HAB-7菌液稀釋成6個濃度梯度，分別用來對番茄種子進行促生測試。結果顯示：HAB-7對18株植物病原真菌的平均抑菌率為61.03%；其發酵上清液對橡膠樹炭疽病菌的抑制率為56.80%，80%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭疽病菌的抑制率為38.88%；10-4 CFU/mL的HAB-7菌液濃度促進了番茄種子胚根的伸長，長度比CK提高67.76%。HAB-7菌株對植物病原菌有較廣譜的抑菌活性，其分泌的活性物質除了活性蛋白外，可能還有其他的活性物質，低濃度的HAB-7菌液能促進植物根系生長。本研究結果為后續研究其致病機理起到重要的作用。

關鍵詞 解淀粉芽孢桿菌 ；抑菌活性 ；抑真菌蛋白 ；促生作用

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.013

Analysis of Antifungal Activity of Bacillus amyloliquefaciens

HAB-7 Against 18 Phytopathogens

LIU Wenbo1） QIN Chunxiu1） XIONG Yanhong1）

SUN Liang2） LIN Chunhua1） MIU Weiguo1） ZHENG Fucong1）

（1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/

College of Environment and Plant Protection，Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China；

2 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737，China）

Abstract HAB-7 is a strain of Bacillus amyloliquefaciens isolated from the rhizosphere of Vigna unguiculata and has a strong inhibitory effect on phytopathogen. The strain HAB-7 was tested against 18 phytopathogenic fungi， and the crude protein extracted from the fermented HAB-7 was also tested against the phytopathogens to observe their inhibitory activities. The tomato seeds were treated with the strain HAB-7 to observe their germination and growth. Dural culture assay was used to test the antibacterial activity of HAB-7 against 18 plant pathogens. The antifungal crude protein extracted from the supernatant of fermented HAB-7 via precipitation of 60% or 80% ammonium sulfate was tested against the fungi of rubber anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides Penz. CGR-1 strain which was used as an indicator pathogen. The HAB-7 was diluted into 6 different concentrations， with which tomato seeds were treated to observe their germination and growth. The HAB-7 had an average inhibition rate of 61.03% against the 18 fungi； the supernatant of the fermented HAB-7 inhibited 56.80% of C. gloeosporioides； the crude protein of HAB-7 extracted via 80% ammonium sulfate precipitation also inhibited 38.88% of C. gloeosporioides. HAB-7 bacterial suspension at 1×104 CFU/mL improved the radical growth of the tomato seeds， 67.76% longer than the control. The HAB-7 displayed a broad-spectrum antagonistic activity， and its secreted antagonistic active substance contained antifungal protein and probably other active substances since HAB-7 bacterial liquid at a low concentration promoted plant root growth. This study plays an important role in follow-up study about its pathogenicity.

Keywords Bacillus amyloliquefaciens ； antifungal activity； antifungal protein； growth promotion

芽孢桿菌屬（Bacillus spp）中，許多菌株能抑制植物病原菌，部分能促進植物生長[1]，有些菌株兩種功能同時兼有。目前研究的芽孢桿菌中具有抑菌活性的主要有：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（B. atropheaus）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）等[2-6]。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）在其生長過程中，可以產生抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量的胞外代謝活性物質，能很好地抑制多種植物病原菌[7-8]，這些胞外物質在防治植物病害中起著重要的作用[9]，有些菌株除了能防治病害還能促進植物生長[10]。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣，容易分離，大多分離自植物根系土壤附近[11]，對環境友好，且對人畜無毒，在環境中也不容易產生抗性[12-13]。由于分泌的抗菌蛋白對植物病原菌抑制機理特殊，不容易產生抗性，因而受到了國內外科研工作者的廣泛關注[14]。

本實驗室從豇豆根際土壤中分離篩選到對植物病原真菌有較強拮抗作用的細菌HAB-7菌株，初步研究HAB-7菌株及其代謝產物對植物病原真菌的抑制效果，為今后進一步研究其抗菌機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細菌和真菌

供試細菌：HAB-7是本實驗室從豇豆根際土壤中分離獲得的一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

供試植物病原真菌（表1）為本實驗室分離鑒定后保存，均經過單孢分離純化備用。

1.1.2 供試培養基

PBA培養基；優化培養基（蔗糖30 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母粉30 g/L、胰蛋白胨40 g/L）。往以上培養基加入18 g/L瓊脂粉制即可作成固體培養基。其中PDA培養基用于培養植物病原真菌。

1.2 方法

1.2.1 HAB-7對18株植物病原真菌的拮抗作用

將供試植物病原真菌接種至PDA培養基平板上培養5 d；用打孔器在菌落邊緣打直徑0.4 cm的菌餅，將其接種到優化培養基平板（9 cm）中央，在菌餅4個角等距離接種HAB-7菌株，以不接HAB-7菌株的培養基為對照，均置于28℃恒溫暗培養；待對照組菌落直徑生長至整個培養皿（9 cm）的三分之二時，測量植物病原真菌菌落直徑[15]，并測定HAB-7對供試病原真菌的拮抗作用。

抑制率=（對照組菌圈直徑-處理組菌圈直徑）/對照組菌圈直徑×100%

1.2.2 HAB-7發酵上清液及發酵液粗蛋白對植物病原真菌的抑制作用

（1）HAB-7發酵上清液對橡膠樹炭疽菌的抑制作用：將HAB-7接種到優化的液體培養基中，置于 28℃、200 r/min恒溫培養箱中振蕩培養72 h；取出后用高速冷凍離心機（eppendorf，5804R）以4℃、11 000 r/min離心30 min，取上清液；在超凈工作臺上，將上清液用細菌過濾器（Φ=0.22 μm）過濾除菌，把濾液存放在10 mL已滅菌的離心管中，于 4℃冰箱儲存備用。在PDA 培養基平板上，用打孔器打4個成等邊形的圓孔，在等邊形中心處接上 1 個橡膠樹炭疽菌菌餅，于28℃培養1 d后，將過濾除菌的胞外代謝物分別加到4個孔中，重復3次，將平板放入28℃恒溫培養箱中培養，觀察結果并測量[15]。

（2）HAB-7發酵液粗蛋白對橡膠樹炭疽菌的抑制作用：將HAB-7接種于優化的液體培養基中，置于 28℃、200 r/min恒溫培養箱中振蕩培養72 h；取發酵液，用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心，取發酵上清液100.0 mL，緩緩地向上清液中加入固體硫酸銨至60%飽和度，于4℃靜止過夜；用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀。向收集的上清液中繼續加入固體硫酸銨，按照同樣的方法調節至80%硫酸銨飽和度，收集沉淀蛋白；用適量的10.0 mmol/L、pH 7.0 的磷酸緩沖液（PBS）溶解，裝入透析袋中，用相同濃度的PBS緩沖液透析過夜；用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心透析液20 min，棄沉淀，將上清液過濾除菌，稀釋成相同的濃度，接種方法同（1）。

1.2.3 HAB-7對番茄種子的促生作用

用75%酒精浸泡番茄種子15 s，再將種子用3%的NaClO消毒30 min，最后用無菌水漂洗6次；將HAB-7菌液分別稀釋成0倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍的菌懸液，分別取菌懸液和無菌水各5 mL，存放在10 mL的離心管中；分別將處理過的30粒番茄種子放入上述不同濃度的稀釋液中，置于28℃恒溫培養箱中培養12 h后取出，用無菌水清洗番茄種子6遍；將每個處理的番茄種子整齊地擺放在無菌的培養皿中，往培養皿中加入少量無菌水，每個培養皿放入6粒番茄種子，置于4℃冰箱72 h，再放入28℃光照培養箱光暗交替培養5 d。每個處理組3次重復，記錄番茄種子根的長度[16-17]，以無菌水處理為對照（CK）。

2 結果與分析

2.1 抑菌作用測定

采用平板對峙法培養后，HAB-7對18株植物病原真菌的抑菌作用見圖1。通過計算得出HAB-7對18株植物病原真菌的平均抑菌率為61.03%，并在0.05及0.01的水平上差異均顯著，表明其對18株植物病原真菌的抑菌率存在差異，具有很好的抑菌潛力；對病原菌抑菌率最高的真菌是CGR-1（70.13%），最低的是COC-1（50.22%）（圖2，表2）。同一種病原菌，來源不同，HAB-7對其抑制率也不相同，可能跟其抗藥性及致病性有關。

2.2 HAB-7發酵上清液對病原真菌的影響

HAB-7發酵上清液對橡膠樹炭疽病菌有明顯的抑制作用（圖3），經計算可知其抑制率為56.80%。初步推測HAB-7發酵上清液中可能含有某些活性物質（抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量抗生素等），其抑菌活性跟HAB-7菌株直接作用相當，說明HAB-7菌株主要是靠分泌活性物質來抑制病原菌菌絲的生長。

2.3 HAB-7粗蛋白對橡膠樹炭疽病菌的影響

HAB-7的80%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭疽病的抑制率可達42.88%；60%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭病菌無抑菌活性，在后期能被真菌菌絲全部覆蓋?。▓D4）。在80%硫酸銨高濃度提取下，所得粗蛋白才對橡膠樹炭疽病菌具有強烈的抑制效果，可知沉淀蛋白中含有抗菌活性蛋白，但含量可能少，其平均抑制率僅為38.88%，比其上清液的抑制率少17.92%。說明HAB-7菌株的發酵上清液中，除了抗菌蛋白，還有其他的活性物質抑制了植物病原真菌的生長。

2.4 HAB-7對番茄種子的促生作用

從圖5可知，用10-4 CFU/mL的稀釋菌液處理的番茄種子，其促生效果比以無菌水作對照（CK）的好。高濃度（10-2、10-1、原液）對番茄種子的胚根伸長具有一定的抑制作用，其它經稀釋的菌液對番茄種子胚根都具有一定的伸長作用，尤其是在10-4 CFU/mL菌液濃度下，胚根長度與CK相比差異達到極顯著水平，提高了67.76%（圖6，表3），可見在此條件下，促生作用最為強烈，說明HAB-7的分泌物中存在對植物具有促生作用的物質。

3 討論與結論

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布比較廣，是一種重要的生防資源，對植物病原真菌或植物病原細菌能產生抑制作用[18]。本研究結果顯示，HAB-7菌株對供試的18株植物病原真菌（主要是半知菌類）都有明顯的抑制作用，平均抑菌率為61.03%，表明HAB-7菌株對半知菌類植物病原真菌具有抑制作用，且具有較強的次生代謝物產生能力，能產生多種抑菌物質[19]。解淀粉芽孢桿菌易于發酵， 且會將抑真菌蛋白分泌到胞外，抑真菌蛋白又具有性質穩定、水溶性等優點[20]。利用最優培養基（另文發表）培養HAB-7菌株，將其發酵上清液及80%硫酸銨沉淀蛋白與橡膠樹炭疽病菌進行對峙培養，結果顯示，上清液的抑制效果比粗提蛋白抑制效果提高了17.82%，表明發酵上清液中除了少量的抑菌蛋白，還有其他抑制病原菌的活性物質。芽孢桿菌的細胞膜上，有3種類型的蛋白泌出通道，能分泌出不同種類及大小的蛋白[21]；其分泌的抗菌蛋白和活性蛋白與環境和培養條件有關[22]。番茄種子發芽實驗表明，高濃度的HAB-7能抑制番茄種子的萌發生長；在10-4 CFU/mL濃度下平均根長比CK長45.92 mm，促生效果明顯。說明HAB-7菌株的次級代謝產物中含有一類植物激素類物質，可促進植物的生長，但是具體哪類物質還需進一步研究。

近年來，拮抗芽孢桿菌的篩選研究工作開展得較多，研究者也甚多[23]。目前的許多研究都僅僅停留在實驗室階段，真正分離純化得到的活性物質尚達不到要求或穩定性較差[24]。雖然很多的芽孢桿菌已經獲得農藥登記許可證[25]，但是還有很多只能在實驗室條件下才能表現出良好的抑菌活性，而在大田條件下，由于環境條件的改變，許多拮抗微生物不能很好地適應田間微環境，因此無法快速地生長繁殖，從而難以發揮抑菌作用。提高生防菌在田間葉片及根際的快速繁殖能力，是研究者需要考慮并解決的問題。

參考文獻

[1] 劉 俊. 解淀粉芽孢桿菌C06防治桃褐腐病菌的機制及其產生的γ-多聚谷氨酸在定殖中的作用[D]. 南京： 南京農業大學， 2010.

[2] Toure Y， Ongena M， Jacques P， et al. Role of lipopeptides produced by Bacillus subtilis GA1 in the reduction of grey mould disease caused by Botrytis cinerea on apple[J]. Journal of Applied Microbiology， 2004， 96（5）： 1 151-1 160.

[3] Yoshida S， Hiradate S， Tsukamoto T， et al. Antimicrobial activity of culture filtrate of Bacillus amyloliquefaciens RC-2 isolated from mulberry leaves[J]. Biological Control， 2001， 91（2）： 181-187.

[4] 權春善，王軍華，徐洪濤，等. 一株抑真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發酵條件的初步研究[J]. 微生物學報，2006，46（1）：7-12.

[5] 孫 亮，劉文波，楊廷雅，等. Bacillus subtilis HAB-1在不同培養基上的形態觀察及抑菌活性測定[J]. 廣東農業科學，2013（13）：76-80.

[6] 楊廷雅， 孫 亮， 周婷婷， 等. 短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs） HAB-5主要抑菌活性成分的分析及其特性研究[J]. 中國生物防治，2014，30（2）：222-231.

[7] Chen X H， Koumoutsi1 A， Scholz R， et al. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth of promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Nature Biotechnology， 2007，25：1 007-1 014.

[8] 王英國，王軍華，權春善，等. 解淀粉芽孢桿菌抗菌活性物質的分離純化及抑菌活性研究[J]. 中國生物工程雜志，2007，27（12）： 41-45.

[9] Chen X H， Vater J， Piel J， et al. Structural and functional characterization of three polyketide synthase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J]. Journal of Bacteriology， 2006， 188（11）： 4 024-4 036.

[10] Emmert E A， Handelsman J. Biocontrol of plant disease：a（gram-）positive perspective[J]. FEMS Microbiol Lett， 1999， 171（1）： 1-9.

[11] 王曉輝，王貴鵬，張慶芳，等. 一株抗灰霉病解淀粉芽孢桿菌的篩選鑒定及抑菌蛋白的分離[J]. 吉林農業科學，2015，40（1）：64-67.

[12] 孟利強，李 晶，張淑梅，等. 解淀粉芽孢桿菌TF28抗菌粗蛋白的初步研究[J]. 中國林副特產，2011（5）：10-13.

[13] 張少飛，李 敏，邢志國，等. 產抑菌物質SDLH菌株的鑒定及發酵產物穩定性研究[J]. 生物技術，2009，19（5）：56-61.

[14] 出曉銘，林毅雄，張 珅，等. 生防菌解淀粉芽孢桿菌抗菌蛋白的研究進展[J]. 包裝與食品機械，2014，32（6）：49-54.

[15] 安 霞. 生防細菌的農藥降解特性及其降解機制的研究[D]. 濟南：山東師范大學，2010.

[16] 袁玉娟. Bacillus subtilis SQR9的黃瓜促生和枯萎病生防效果及其作用機制研究[D]. 南京： 南京農業大學， 2011.

[17] 張 蕾. 枯草芽孢桿菌BSD-2發酵條件及對黃瓜防病促生作用機理研究[D]. 石家莊：河北師范大學，2009.

[18] 張榮勝，王曉宇，羅楚平，等. 解淀粉芽孢桿菌 Lx-11 產脂肽類物質鑒定及表面活性素對水稻細菌性條斑病的防治作用[J]. 中國農業科學，2013，46（10）：2 014-2 021.

[19] 吳一晶，林藝芬，林河通，等. 生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進展[J]. 包裝與食品機械，2012，30（6）：49-52.

[20] 郝建安，曹志輝，趙鳳梅，等. 解淀粉芽孢桿菌 NK10.BAhjaWT 抑真菌作用的研究[J]. 微生物學通報，2008， 35（6）： 903-908.

[21] Fu L L， Xu Z R， Li W F， et al. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis： Implication for optimization of heterologous protein secretion[J]. Biotechnology Advances， 2007， 25： 1-12.

[22] Moita C， Feio S S， Nunes L， et al. Optimisation of physical factors on the production of activemetabolites by

Bacillus subtilis 355 against wood surface contaminant fungi[J]. International Biodeterioration and Biodegradation， 2005， 55： 261-269.

[23] 陳 哲，黃 靜，趙 佳，等. 解淀粉芽孢桿菌抑菌機制的研究進展[J]. 生物技術通報，2015，31（6）：37-41.

[24] 洪 鵬，安國棟，胡美英，等. 解淀粉芽孢桿菌防治果蔬采后病害研究進展[J]. 中國農學通報，2013，29（12）：168-173.

[25] 何鵬飛. B9601-Y2菌株的基因組解析及部分功能驗證[D]. 武漢：華中農業大學，2014.

① 基金項目：2015年海南省自然科學基金（No.20153131）；海南省產學研項目（No.CXY20140038）；國家農業產業技術體系建設（No.CARS-34-GW8）；農業部2013年熱作農技推廣與體系建設項目（No.13RZNJ-20）。

收稿日期：2016-10-12；責任編輯/林海妹；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 劉文波（1978～），男，碩士，主要研究方向為從事熱帶植物病理，E-mail：saucher@163.com。

③ 通訊作者：繆衛國（1969～），男，博士，教授，主要研究方向為分子植物病理等，E-mail： weiguomiao1105@126.com；

鄭服叢（1956～），男，教授，主要研究方向為植物病理學，E-mail： zhengfucong@126.com。