UPLC—ESI—Q—TOF—MS/MS分析槲皮苷在大鼠

覃小麗+孫慧園+楊武+李勇軍+鄭林+劉亭+黃勇

[摘要]該試驗主要研究槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝情況及其可能的生物轉化途徑，為中藥糖苷類成分的代謝機制奠定基礎。建立超高效液相色譜串聯電噴霧飛行時間質譜測定槲皮苷及其代謝產物的分析方法，流動相為01%甲酸水01%甲酸乙腈，梯度洗脫，流速為03 mL·min-1，掃描方式為電噴霧負離子模式，將大鼠腸道菌群在體外與槲皮苷共同孵育使其發生代謝，采用此方法對其代謝產物進行檢測分析，結合Metabolite ToolsTM，質量虧損過濾（MDF）等技術，對代謝產物進行篩查分析以及推測代謝產物化學式。結果顯示，槲皮苷發生脫糖、脫氧、乙?；确磻?，脫糖生成的苷元槲皮素進一步發生羥基化、脫氧、還原、開環等反應，得到槲皮素脫氧代謝產物山柰酚、槲皮素C2C3雙鍵加氫還原產物花旗松素、槲皮苷脫糖基產物槲皮素等。研究結果表明槲皮苷能夠在大鼠腸道菌群中發生代謝，增加了化合物的疏水性和化學多樣性。

[關鍵詞]槲皮苷； 腸道菌群； UPLCQTOFMS/MS； 代謝

Analysis of metabolites of quercitrin in rat intestinal flora by using

UPLCESIQTOFMS/MS

QIN Xiaoli1，2，4， SUN Huiyuan1，2 ， YANG Wu1，2 ， LI Yongjun3， ZHENG Lin1 ， LIU Ting1， HUANG Yong1*

（1 Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guiyang 550004， China；

2 School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China，

3 Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine，

Ministry of Education， Guiyang 550004， China，

4 National Engineering Research Center of Miao′s Medicines， Guiyang 550004， China）

[Abstract]To investigate the metabolism of quercitrin in rat intestinal flora and possible biological pathways， laying the foundation for the metabolic mechanism of traditional Chinese medicine glycosides ingredients UPLCQTOFMS/MS method was established to detect the quercitrin and its metabolites with 01% formic acid solution（A）01% formic acid acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 03 mL·min-1 Electrospray negative ion mode was applied to analyze the metabolites of quercitrin in rat intestinal flora Metabolite ToolsTM， mass defect filter（MDF） and other technologies were used to screen， analyze the metabolites and infer the chemical formula of the metabolites The results showed that quercitrin would have degalactoside， deoxygenation and acetylation reactions， and the aglycone quercetin resulted from degalactoside would have further reactions such as hydroxylation， deoxygenation， reduction， and ring opening to achieve deoxygenation metabolite kaempferol， C2C3 double bonds hydrogenation and reduction product taxifolin， and degalactoside product quercetin The research results showed that quercitrin can be metabolized by rat intestinal flora， which could increase their hydrophobicity and chemical diversity

[Key words]quercitrin； intestinal flora； UPLCQTOFMS/MS； metabolism

中藥糖苷類成分是中藥中一類重要的活性成分，其突出的藥效活性受到廣泛關注，相關研究表明，糖苷類成分在腸道較難吸收，生物利用度低，在體內難直接發揮作用[1]，然而卻能發揮藥效，這可能是腸道中存在大量的細菌[2]，使糖苷代謝成各種代謝產物，其代謝產物可能才是真正起藥理活性的成分，因此口服中藥糖苷類成分的活性與腸道菌群密不可分。而槲皮苷是由槲皮素和鼠李糖基組成的糖苷，具有中樞抑制、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗炎鎮痛等作用[3]，在三七、銀杏葉、葒草花、頭花蓼等藥材中均含有此成分。目前國內研究槲皮苷的藥理藥效[3]、吸收[46]等較多，但是關于槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝情況尚不明確，因此本文采用UPLCQTOFMS/MS聯用技術，并在厭氧環境下研究槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝規律，對槲皮苷及其類型的糖苷代謝機制具有十分重要的意義。

1材料

CDH6000BⅡ電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SWCJ2FD超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；YXQLS18SI手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司）；厭氧產氣袋（AnaeroPackAnaero，MGC，日本三菱瓦斯化學株式會社）；厭氧培養罐（PackRectangular Jars，日本三菱瓦斯化學株式會社）；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統（包括1290 Infinity二元泵，高性能自動進樣器，二級管陣列檢測器，柱溫箱）；ESIQTOFMS（布魯克道爾頓電噴霧四極桿飛行時間質譜儀，包括Metabolite ToolsTM，MDF技術等）；Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman Coulter 公司）；MTN2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；EL204電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）。

營養瓊脂培養基（批號2014030401）和小牛浸膏（批號2014010800）購于杭州微生物試劑有限公司；硫酸銨（批號20120305）購于重慶川江化學試劑廠；磷酸氫二鉀（批號20130722）和碳酸鈉（批號20131206）購于上?；瘜W試劑總廠；無水氯化鈣（批號2013101801）和硫酸鎂（批號20130522）購于成都市科龍化工試劑廠；磷酸二氫鉀（批號120202）和氯化鈉（批號130927）購于西隴化工股份有限公司；L半胱氨酸（批號100125）購于上海藍季科技發展有限公司；L抗壞血酸（批號402C036）購于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨（批號130941）購于上海博微生物科技有限公司；槲皮素對照品（批號1166101216）購于中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；槲皮苷（批號MB6680）和山柰酚（批號MB6888）對照品購于大連美侖生物科技有限公司；花旗松素對照品（批號 111816201102）購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；水為屈臣氏超純水；其他試劑均為分析純。

健康SD大鼠，雌雄兼用，體重（200～240） g，由貴州醫科大學動物中心提供，編號SCXK（黔）20020001。動物進入實驗室后，雌雄分飼，由專人飼養管理，動物室按常規定期消毒。

2方法

21色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱（21 mm×100 mm，18 μm）；流動相01%甲酸水（A）01%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～10 min，95%～55%A，10～14 min，55%～5% A，14～15 min，5%～0%A，15～16 min，0%～95%A；柱溫45 ℃；流速03 mL·min-1，進樣量2 μL。

22質譜條件

電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負離子模式（ESI-，m/z 50～1 000）；毛細管電壓3 kV，錐孔電壓80 V；離子源溫度110 ℃，霧化氣溫度200 ℃，霧化氣（N2）壓力 12 bar，流速80 L·min-1；脫溶劑氣溫度300 ℃，霧化氣（N2）體積流量50 L·h-1，脫溶劑氣體積流量550 L·h-1。準確質量測定采用甲酸鈉校正標準液，校正模式選用Enhanced Quadratic。數據分析：Data Analysis軟件，Metabolite ToolsTM 軟件（包括Metabolite Predict及Metabolite Detect），質量虧損過濾（MDF）。

23厭氧培養液的制備[7]

A液375 mL（078% K2HPO4），B液375 mL[047% KH2PO4，118% NaCl，12% （NH4）2SO4，012% CaCl2，025% MgSO4·H2O]，C液50 mL 8% Na2CO3。05 g L半胱氨酸，2 mL 25% L抗壞血酸，1 g牛肉膏，1 g蛋白胨，1 g營養瓊脂，加蒸餾水至1 L，鹽酸調pH 75～80。

24大鼠腸道菌液的制備[8]

將健康大鼠斷頸處死后，迅速開腹取其大腸段糞便，將新鮮糞便與生理鹽水按1∶4混合制成混懸液，5 000 r·min-1離心5 min，上清液即為大鼠腸道菌液。

25樣品的制備

251腸菌培養液取新鮮配制的腸道菌液2 mL于培養皿中，加入厭氧培養液18 mL（已滅菌），混合均勻，即得20 mL腸菌培養液。將此腸菌培養液置于厭氧培養罐中，加入1個厭氧產氣袋后，迅速蓋上培養罐蓋以保證培養環境厭氧[910]，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，使腸菌培養液中的腸道菌充分成長。

252試驗分組24 h后取出培養皿，將上述腸菌培養液平均分為2份，每份10 mL。實驗分為3組，將槲皮苷加入10 mL腸菌培養液中得給藥組，10 mL腸菌培養液（不含槲皮苷）為空白組，將槲皮苷加入10 mL厭氧培養液（不含腸菌）為對照組。每個樣品平行操作3次。將上述培養皿迅速放入厭氧培養罐中，放入1個厭氧產氣袋，以保證培養環境厭氧[910]，置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。所用器具均經高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min。

26樣品處理方法

將25項下培養得到的樣品分別轉移至50 mL離心管中，每管中加入乙酸乙酯10 mL，渦混震搖3 min，提取3次，合并萃取液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，在37 ℃下N2吹干，殘渣加1 mL乙酸乙酯溶解后37 ℃下N2吹干，殘渣加200 μL 50%甲醇溶解，15 000 r·min-1離心5 min，上清液UPLCQTOFMS/MS進樣分析。

3結果

31代謝產物分析

在26項下，運用Metabolite Tools軟件中的Metabolite Predict對槲皮苷進行代謝產物預測，將生成的代謝產物MassList導入Metabolite Detect中得到槲皮苷大鼠腸道菌孵育樣品、大鼠空白腸道菌孵育樣品、槲皮苷厭氧培養液孵育樣品等的圖譜及差異圖譜，結果見圖1。

覃小麗等：UPLCESIQTOFMS/MS分析槲皮苷在大鼠腸道菌群中的代謝

32化合物鑒定

由Metabolite Detect軟件對樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，在大鼠腸道菌孵育樣品中找到9種化合物，即M0（m/z 447094 3），M1（m/z 317030 5），M2（m/z 303054 3），M3（m/z 305068 6），M4（m/z 431105 1），M5（m/z 489106 3），M6（m/z 489106 3），M7（m/z 301038 1），M8（m/z 301038 1），見表1。

321M0tR 61 min色譜峰的準分子離子為m/z 447094 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 301037 9 [M-H-C6H10O4]-，與槲皮苷對照品相同，由此確定化合物M0為原型成分槲皮苷。

322M1tR 45 min色譜峰的準分子離子為m/z 317030 5[M-H]-，由Smart Formula預測其化學式為C15H9O8，與原型化合物m/z 447094 3[M-H]-相比減少了130，為失去1個鼠李糖基生成槲皮素的衍生物，且其保留時間較槲皮素縮短，親水性增加，可能是槲皮素再羥化的結果，故推測M1為槲皮素的羥基化代謝產物，但本實驗的數據并不能說明具體羥化位置，有待進一步研究。

323M2tR 56 min色譜峰的準分子離子為m/z 303054 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 285[M-H-H2O]-，與花旗松素對照品相同，確定tR 56 min的M2為槲皮素C2C3雙鍵加氫還原產物，即花旗松素。

324M3由Metabolite Detect軟件對樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜中可知，tR 58 min色譜峰的準分子離子為m/z 305068 6[M-H]-，m/z 183031 0 [M-H-C7H6O2]-，125024 9[M-H-C7H6O2-COO-CH2]-為主要碎片離子峰，由此推測tR 58 min的M3為苷元C2C3雙鍵加氫還原后OC2鍵開環產物。

325M4由Metabolite Detect軟件對樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，tR 68 min色譜峰的準分子離子為m/z 431101 5[M-H]-，由Smart Formula預測其化學式為C21H19O10，且其保留時間較槲皮苷延長，疏水性增加，由此推測tR 68 min的M4為槲皮苷脫羥基產物。

326M5和M6由Metabolite Detect軟件對樣品及空白圖譜處理后得到的差異圖譜可知，tR 72，76 min色譜峰的準分子離子皆為m/z 489106 3[M-H]-，主要碎片離子峰為m/z 447094 7[M-H-C2H2O]-，301145 1[M-H-C2H2O-C6H10O4]-，由此推測tR 72，76 min的M5，M6為槲皮苷乙?；x產物，具體的乙?；恢糜写M一步研究。

327M7tR 80 min色譜峰的準分子離子為m/z 301038 1[M-H]-，與M0相比減少了146，與槲皮素對照品相同，由此確定tR 80 min的M7為槲皮苷脫糖基后的苷元，即槲皮素。

328M8tR 92 min色譜峰的準分子離子為m/z 285043 1[M-H]-，與M7相比減少了16，與山柰酚對照品相同，確定tR 92 min的M8為槲皮素3′脫氧代謝產物，即山柰酚。

33槲皮苷代謝產物及其可能的代謝途徑

根據上述分析，推測槲皮苷代謝產物及其可能的代謝途徑見圖2。

4討論

槲皮苷屬于中藥黃酮糖苷類。過去一直認為黃酮類物質槲皮苷及其衍生物很少被吸收，但近幾年有關研究顯示，槲皮苷及其衍生物進入機體后，有一部分通過被動吸收和主動轉運而被機體吸收利用[11]，但是槲皮苷在體內并不是完全以原型成分吸

收入血，而是在體內代謝轉化器和酶系的多樣性作用下，受到大量的腸道菌群作用，影響其代謝轉化和機體的吸收利用[1213]。

傳統中藥的使用大多數是通過口服吸收而發揮作用，藥物在生物體內作用不可避免與腸道菌群接觸。腸道是一個龐大而富有活力的細菌菌群棲息地，人和動物腸內菌叢數量和種類繁多，且99%是厭氧性細菌，其中以擬桿菌族、鏈狀細菌、消化鏈球菌、螺菌屬等專性厭氧菌和乳酸菌及雙歧桿菌占優勢。研究發現在人腸內細菌中的梭桿菌K60能夠使槲皮苷的糖苷鍵斷裂生成槲皮素，擬桿菌JY6和雙歧桿菌B9能夠使槲皮苷的B環開裂[14]。人體的腸道菌群分布特征與大鼠比較相似，并且本課題前期研究槲皮苷在人腸道菌群中的代謝情況也是主要以脫糖基反應為主。因此，槲皮苷的糖苷鍵斷裂生成槲皮素可能與大鼠腸內細菌中的梭桿菌K60有關，確認有待進一步研究。

本實驗采用體外大鼠腸道菌群孵育法，能在較短時間內得到大量的代謝產物，比較方便解決一些復雜藥物代謝研究的問題，代謝環境易于控制，代謝體系比較純凈，在代謝物結構鑒定方面具有較大的優勢[15]。通過UPLCQTOFMS/MS聯用技術，運用Metabolite Predict，Metabolite Detect對樣品中的代謝產物進行預測并檢測分析，結合Mass Defect Filter技術進一步有效提取代謝產物信息，排除基質背景干擾，并應用Data Analysis中Smart Formula功能推測代謝產物化學式。結果表明槲皮苷在大鼠腸道菌群中主要以脫糖基反應為主，苷元槲皮素進一步發生羥基化、脫氧、還原、開環一系列反應，更容易吸收入血，提高藥效。研究中藥腸道代謝可以增加人們對中藥復雜成分在體內生物轉化途徑的理解，為闡明中藥復方相互作用規律、中藥現代制劑的開發以及為中藥及其復方制劑藥效物質闡明奠定基礎。

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[責任編輯曹陽陽]

[收稿日期]20160830

[基金項目]國家自然科學基金項目（81260688）；貴州省研究生卓越人才計劃項目（黔教研合ZYRC字[2014]012）；現代藥物研究開發協同創新中心項目（黔教合協同創新字[2013]04）；民族藥與中藥開發應用產學研基地建設項目（黔科合KY字[2013]122）；貴州省優秀青年科技人才培養對象專項（黔科合人字（2015）11號）

[通信作者]*黃勇，博士，教授，主要從事中藥活性物質基礎及藥動學研究與藥物新劑型、新技術研究，Tel：（0851）86908468，Email：mailofhy@126com

[作者簡介]覃小麗，碩士研究生，主要從事活性物質基礎與藥物新劑型研究， Email：2806247283@qqcom