GC法同時測定蟬花中三種脂肪酸含量

凡軍民　賈君　陳燕

摘要：分析江蘇茅山地區蟬花（Isaria cicadae Miquel）中脂肪酸的組成，建立了同時測定蟬花中十六酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯3種脂肪酸含量的方法。采用氣相色譜-質譜聯用法分析蟬花中脂肪酸的組成，并用氣相色譜法對其主要脂肪酸進行定量分析。結果表明，蟬花中主要有8種脂肪酸，十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯分別在50～500 μg/mL（r=0.999 9）、100～1 000 μg/mL（r=0.999 5）、20～200 μg/mL（r=0.999 3）線性關系良好，平均回收率分別為97.66%、98.13%、97.33%，RSD分別為1.02%、0.73%、1.03%（n=9）。

關鍵詞：蟬花（Isaria cicadae Miquel）；氣質聯用；氣相色譜；脂肪酸；含量測定

中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0727-04

蟬花（Cordyceps cicadae）又稱金蟬花、蟬花蟲草、蟬蛹草，是蟲草科（Claviceplaceae）棒束孢屬（Isasia）的寄生蟬類若蟲形成的蟲生真菌，為中國傳統的中藥材[1，2]。其具有清熱、解毒、驅風、鎮痛和明目等多種功效。與名貴中藥材冬蟲夏草的無性同屬，且具有相似的化學成分及藥用價值[3，4]?，F代臨床研究表明，蟬花具有調節免疫功能[5-7]、抗腫瘤[7-10]、改善腎功能[11，12]、促進造血[13]等藥理作用。

蟬花化學成分復雜多樣，主要集中在核苷類物質、多糖、多球殼菌素、麥角甾醇等生物活性成分的研究[11，14]，關于脂肪酸成分及含量的研究報道較少。本研究采用GC-MS法分析江蘇茅山地區蟬花中脂肪酸的成分，并用GC法測定其中3種主要脂肪酸十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯的含量，為蟬花中脂肪酸的鑒別和含量測定提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AL 204型電子分析天平，梅特勒·托利多公司；MD 200型氮氣吹掃儀，杭州奧盛儀器有限公司；Agilent 7890A GC-5975C MSD型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司。

1.1.2 試藥 正己烷（色譜純）、正十八烷（產品編號40037161，沃凱GCS）由國藥集團化學試劑有限公司提供，十六烷酸甲酯（標物編號SH-N-16-M-100 mg）、亞油酸甲酯（標物編號111625）、油酸甲酯（標物編號190034）均由北京萬佳首化生物科技有限公司提供。蟬花產自江蘇省句容市磨盤山。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

1）內標溶液的配制。精密稱取0.146 5 g正十八烷，置于50 mL容量瓶中，用環己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質量濃度為2.93 mg/mL。

2）對照品溶液的配制。a.精密稱取十六烷酸甲酯對照品250 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質量濃度為5 mg/mL。b.精密稱取油酸甲酯對照品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質量濃度為10 mg/mL。c.精密稱取亞油酸甲酯對照品100 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質量濃度為2 mg/mL。d.混合標準溶液：十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯各取1.0 mL，定容于10 mL容量瓶，質量濃度分別為0.5、1.0、0.2 mg/mL。

1.2.2 樣品制備

1）蟬花預處理。將蟬花去泥洗凈，50 ℃烘至恒重，粉碎，過60目篩，備用。

2）蟬花脂肪酸的超聲提取。精密稱取0.5 g蟬花粉末，置于具塞試管中，加正己烷10 mL，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，過濾，重復2次。將2次的抽提液合并，用N2氣將濾液吹干（50 ℃），重復6次。取3次重復，用2 mL正己烷復溶，混勻，過0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

3）脂肪酸的甲酯化處理。在吹干的蟬花脂肪酸中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱10～15 min，取出冷卻，加入內標溶液 0.2 mL、正己烷1.8 mL，靜置10 min，取上清液，過 0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

1.2.3 分析方法

1）氣相色譜條件。HP-5MS型毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度190 ℃，保持17 min，30 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min，5 ℃/min升溫至280 ℃；進樣口溫度280 ℃，FID 檢測器溫度290 ℃；載氣高純氮氣，流速1 mL/min；進樣量1 μL，分流比20∶1。

2）質譜條件。EI電離源，電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度290 ℃；離子源掃描質量范圍（m/z）50～550；溶劑延遲5 min；通過NIST11標準譜庫檢索，并與標準圖譜核對進行定性分析，按面積歸一化法進行定量，測得其相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 蟬花中脂肪酸成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析蟬花脂肪酸，其成分的總離子流色譜見圖1。對各峰進行分析，共鑒定出8種脂肪酸類成分。由表1可以看出，蟬花脂肪酸有3種主要成分，分別為十六酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯。

2.2 色譜條件與系統適用性

在“1.2.3”色譜條件下分析，按“1.2.2”方法制備供試溶液，3種脂肪酸甲酯色譜峰之間的分離度均大于1.5，表明相鄰色譜峰達到完全分離，色譜圖見圖2。

2.3 線性關系考察

分別取混合對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，加內標溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，搖勻，即得5個濃度混合對照品溶液。將混合對照品溶液按“1.2.3”色譜條件測定，重復進樣3次，記錄各成分峰面積值。以峰面積比（A對照品/A內標）為縱坐標，濃度比（C對照品/C內標）為橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。十六酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯的回歸方程分別為Y=0.070 7X+0.002 4（r=0.999 9），Y=0.380 0X+0.006 3（r=0.999 5），Y=0.017 6X+0.005 6（r=0.999 3），在50～500 μg/mL、100～1 000 μg/mL、20～200 μg/mL范圍內3個脂肪酸甲酯的標準曲線線性關系好。

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液1.2 mL，加內標溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，搖勻，重復進樣6次，以峰面積比（A對照品/A內標）計算精密度，測得A十六酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.47%；A油酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.48%； A亞油酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.47%，符合試驗要求。

2.5 穩定性試驗

取甲酯化處理后的脂肪酸供試溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積值。十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、峰面積的RSD（n=6）分別為3.3%、3.1%、3.0%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗

取蟬花粉末6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定，測得十六酸甲酯平均含量為0.26%，RSD為2.51%；測得油酸平均含量為1.86%，RSD為2.68%；亞油酸平均含量為0.54%，RSD為2.56%，表明樣品制備的重復性好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取蟬花粉末0.5 g，共9份，加入適量不同濃度脂肪酸甲酯對照品溶液，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定。十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯平均回收率和RSD見表2。

2.8 含量測定

精密稱取蟬花粉末6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定。以保留時間定性，根據外標法以峰面積定量，由標準曲線計算脂肪酸的含量。蟬花中十六酸、油酸、亞油酸的含量（w）分別為（0.26±0.09）%、（1.86±0.14）%、（0.54±0.11）%。

3 討論

3.1 主要脂肪酸的確證

通過GC-MS法確證了江蘇茅山地區蟬花中8種脂肪酸成分，采用GC法同時測定其中3種主要脂肪酸成分十六酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯的含量。蟬花中油酸甲酯和亞油酸甲酯2種不飽和脂肪酸含量較高，相對百分含量分別為9.27%、62.39%，益于心、腦、腎、血管的健康。研究表明，油酸對腫瘤、肉癌、乳癌、肺癌及B細胞白血病等癌癥顯示出強的活性，在腫瘤的預防和治療中發揮了積極的作用。亞油酸是人體不能合成或是合成的量遠不能滿足需要的必需脂肪酸，具有降低血脂、血壓，軟化血管，促進微循環作用，能預防動脈粥樣硬化及心腦血管疾病。因此，蟬花中不飽和脂肪酸油酸和亞油酸的含量與相關藥理學的關系有待進一步研究。

3.2 色譜條件的選擇

采用150～180 ℃柱溫作為初始溫度，除溶劑峰外，色譜圖基本沒有峰；以190 ℃作為初始溫度進行程序升溫，結果色譜峰的分離效果較好且基線平穩。樣品采用分流進樣20∶1，測定用樣品含量在標準曲線內，色譜峰并能完全分離。

3.3 提取方法的選擇

采用超聲提取、索氏提取2種方法進行提取，蟬花中脂肪酸相對含量分別為17.32%、14.42%，索氏提取法提取脂肪酸比超聲提取法高3%；用索氏提取法提取測得蟬花中十六酸、油酸、亞油酸的含量（w）分別為（0.27±0.05）%、（2.35±0.16）%、（0.61±0.08）%，2種方法提取的十六酸、亞油酸含量無差異，索氏提取法提取測得蟬花中油酸含量高于超聲提取法。索氏提取法方法較繁瑣、加熱回流時間較長，因此選擇超聲提取。

4 小結

本研究采用超聲提取法提取蟬花中脂肪酸，用GC-MS法對其成分進行定性分析，并對其中十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯3種主要脂肪酸的含量測定。經方法學考察，該檢測方法重復性好，氣相色譜圖基線平穩，可用于蟬花中脂肪酸含量的測定。

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