CQ復方對癌侵襲鏡像痛模型小鼠的鎮痛作用及其中樞機制探討

姜宇懋+孫丹丹+王志國+李濤+趙小亮+焦玥+劉洋+李玉娟+歐陽竟鋒+王丹巧

[摘要] 該研究旨在了解CQ復方對癌侵襲鏡像痛（cancer invasion induced mirror image pain，CIIMIP）模型小鼠的鎮痛作用及其相關中樞機制。將雄性BALB/c小鼠隨機分為正常組、操作對照組（注射0.2 mL滅活的S180肉瘤細胞液）、模型組（于右腿股骨大轉子處注射0.2 mL S180肉瘤細胞液）、CQ復方低劑量組（模型+100 mg·kg-1，ip）、CQ復方中劑量組（模型+150 mg·kg-1，ip）、CQ復方高劑量組（模型+200 mg·kg-1，ip），造模前及術后用Von Frey纖維絲測定鏡像側后足的機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）；采用高效液相-熒光法（HPLC-FLD）檢測脊髓L3～L5節段內谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、?；撬幔═au）濃度；采用AimPlex流式高通量多因子檢測技術檢測L3～L5節段脊髓組織內調節激活T細胞表達與分泌因子（RANTES）、單核細胞趨化蛋白（MCP-3）的含量；并觀察GABAa受體拮抗劑（荷包牡丹堿）對CQ復方鎮痛作用的影響。研究結果發現，CQ復方能夠顯著提高模型小鼠的MWT（P<0.01，P<0.05），降低L3～L5節段脊髓組織內興奮性氨基酸Glu的含量（P<0.01，P<0.05），提高抑制性氨基酸GABA，Gly，Tau的含量（P<0.01，P<0.05），降低Glu/GABA比值（P<0.01，P<0.05），降低RANTES，MCP-3水平（P<0.05）。GABAa受體拮抗劑在2個時間點有意義地降低了CQ復方引起的MWT升高（P<0.05）。該研究結果表明，CQ復方對CIIMIP模型小鼠有顯著的鎮痛作用，其機制與調節中樞神經系統興奮性氨基酸（EAA）/抑制性氨基酸（IAA）遞質的平衡，部分激活GABAa受體，以及減少脊髓組織內促炎性細胞因子RANTES，MCP-3的釋放有關。

[關鍵詞] 癌侵襲鏡像痛； CQ復方； 神經遞質； GABAa受體； 促炎性細胞因子

[Abstract] This study aimed to analyze the analgesic effect and related central mechanisms of CQ prescription on cancer invasion induced mirror image pain （CIIMIP）in model mice.In the study， male BALB/c mice were randomly divided into normal group， operation control group （injected with 0.2 mL inactivated S180 sarcoma cell sap）， model group （injected with 0.2 mL S180 sarcoma cell sap on the right leg near the greater trochanter of femur） and CQ prescription low dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 100 mg·kg-1 on the basis of model mice）， CQ prescription middle dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 150 mg·kg-1 on the basis of model mice）， and CQ prescription high dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 200 mg·kg-1 on the basis of model mice）. Mechanical withdraw threshold （MWT） of the mirror image lateral hind paws were evaluated by Von Frey hairs before modeling and after surgery. The levels of glutamate （Glu）， gamma aminobutyric acid （GABA）， glycine （Gly）， and taurine （Tau） in the L3-L5 spinal cord were measured by the high performance liquid chromatography-fluorescence detector （HPLC-FLD）； AimPlex detection technology with multiple factors was used to detect the levels of regulated on activation in normal T-cell expressed and secreted （RANTES）， monocyte chemoattractant protein （MCP-3） in the L3-L5 spinal cord. Then we observed the influence of GABAa receptor antagonist （Bicuculline） on analgesic effect of CQ prescription.The results indicated that CQ prescription could remarkably increase MWT of model mice（P<0.01， P<0.05）， decrease the level of Glu（P<0.01， P<0.05）， improve the levels of GABA， Gly， Tau（P<0.01， P<0.05）， lower the ratio of Glu/GABA（P<0.01， P<0.05）， and reduce the levels of RANTES， MCP-3（P<0.05） in the L3-L5 spinal cord， and GABAa receptor antagonist significantly blocked the analgesic effect of CQ prescription at two time points（P<0.05）.This study showed that CQ prescription had significant analgesic effect on CIIMIP model mice， and its mechanism was associated with regulating the balance between excitability amino acid（EAA） and inhibitory amino acid （IAA） transmitters in central nervous system， partially activating GABAa receptor， and reducing the release of RANTES and MCP-3 in the spinal cord.

[Key words] cancer invasion induced mirror image pain； CQ prescription； neurotransmitters； GABAa receptor； proinflammatory cytokine

鏡像痛是指當軀體某一部位損傷后，除了損傷部位出現自發性疼痛或痛敏，有時還可導致身體對側相同區域出現自發性疼痛或痛敏[1]。大量的臨床和動物實驗研究表明鏡像痛是一個非常普遍的現象。在臨床上，可觀察到復雜區域疼痛綜合征患者雙側肢體出現明顯的異常疼痛現象[2]。在諸多實驗動物模型上，如慢性壓迫性損傷模型[3]，脊神經結扎模型[4]，實驗性關節炎模型[5]，癌癥疼痛模型[6-7]等都發現了鏡像痛現象。然而，鏡像痛的發生、發展和維持的機制尚不十分清楚，至今治療效果仍不理想。其中，癌癥疼痛出現的鏡像痛既嚴重影響患者的生存質量又干擾癌癥的治療，在臨床上是非常棘手的問題。

本課題組前期已證實CQ復方對于三叉神經痛模型大鼠具有明顯的鎮痛作用，且其作用機制與降低高級痛覺中樞紋狀體內興奮性氨基酸Glu的水平有關[8]。另外，也發現脊髓組織內Glu和GABA含量的平衡在癌侵襲鏡像痛這種疼痛的傳遞機制中發揮著重要的作用[7]。因此，本文擬建立小鼠CIIMIP模型，觀察CQ復方對模型小鼠MWT的影響；采用高效液相-熒光法、AimPlex流式高通量多因子檢測等技術，測定L3～L5節段脊髓組織內Glu，GABA，Gly，Tau，RANTES，MCP-3的含量；研究GABAa受體抑制劑對CQ復方鎮痛作用的影響。明確CQ復方對于癌侵襲鏡像痛是否同樣具有鎮痛作用，并進一步深入探討其可能的鎮痛作用機制。為腫瘤侵襲引起的鏡像痛的機制研究及臨床治療藥物的開發提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF級BALB/c雄性小鼠，體重18～20 g，購于中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK（京）2014-0013。

1.2 瘤株、藥品及試劑 S180肉瘤細胞系由中國中醫科學院中藥研究所惠贈；CQ復方自制，由川芎提取物和青風藤提取物組成，其主要成分鹽酸川芎嗪和鹽酸青藤堿的質量比例為4∶5。Glu，GABA，Gly，Tau，硼酸，乙酸鈉（Sigma公司）；甲醇、四氫呋喃（Fisher Chemicals公司）；鄰苯甲醛（Aldrich公司）；β-巰基乙醇（Amresco公司）；荷包牡丹堿（Bicuculline，Bic）（Selleck公司）；Aimplex Muose Custom 8-plex kit多因子檢測試劑盒（北京曠博生物技術有限公司）。

1.3 儀器 51000-20C Von Frey hairs 疼痛測試包（Danmic公司）；組織研磨儀（IKA，T10 basic ULTRA-TURRAX）；HPLC檢測系統（Sykam S-2100，G1321 A熒光檢測器，Agilent ZORBAX Eclipse AAA 色譜柱及化學工作站）；NovoCyte D1040 流式細胞儀（艾森生物有限公司）；臺式高速離心機（Eppendorf，5417R）。

2 方法

2.1 分組、造模、行為學評價及藥效觀察 將凍存的S180肉瘤細胞注射于健康小鼠腹腔，使其產生癌性腹水，收取后分裝凍存。凍存的腹水瘤細胞復蘇后，臺盼藍染色計數，調整活細胞數為1×107個/mL，置于冰盒內備用。將上述小鼠連續3 d進行預刺激（0.16 g纖維絲刺激小鼠雙側的后足），第4天將右后足MWT ≥0.4 g的小鼠隨機分為正常組（Native組，n=13）、假手術組（Sham組，n=11）、手術組（Surgery組，n=52）。Surgery組小鼠于右腿股骨大轉子（相當于坐骨神經分支部位上方）注射0.2 mL瘤細胞液，Sham組于相同部位注射同等體積相同濃度滅活的瘤細胞液。瘤細胞滅活方法：沸水中煮沸15 min，經臺盼藍染色確定無活細胞。Native組不作任何操作。

采用機械觸痛法測定小鼠的MWT[7，9]。術后第2，3，4，5，6，7天測評小鼠手術部位及對側（鏡像側）后足的MWT，將術后5 ～ 7 d連續3 d MWT≤0.07 g視為造模成功，成模小鼠隨機分為模型組（Model，n=12），CQ復方低劑量組（L-CQ，100 mg·kg-1，n=11）、CQ復方中劑量組（M-CQ，150 mg·kg-1，n=11）、CQ復方高劑量組（H-CQ，200 mg·kg-1，n=12）。各給藥組于術后第8，9，10天腹腔注射相應劑量的藥物，每天1次，Model，Sham及Native組腹腔注射等量的生理鹽水。并于第10天給藥前（即0 min）及給藥后30，60，90，120，180，240 min這7個時間點測評癌侵襲鏡像側后足的MWT。

2.2 脊髓組織內氨基酸水平的檢測 連續給藥第3天，測得癌侵襲鏡像側后足的MWT后，將小鼠脫頸椎處死，置于冰塊上，取L3～L5節段脊髓組織，稱重。加入1 mL冰生理鹽水，組織勻漿儀充分勻漿，后經去蛋白及微粒等前處理得到脊髓勻漿處理液，使用超純水稀釋至適當倍數待測。采用HPLC-FLD法檢測稀釋后的脊髓勻漿處理液中Glu，GABA，Gly，Tau這4種氨基酸的含量，并按脊髓組織質量折算為每1 mg組織內氨基酸的含量。具體檢測方法如下：流動相為A液（緩沖液-甲醇-四氫呋喃400∶95∶5）及B液（緩沖液-甲醇120∶380），流速為0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL。洗脫梯度：0～10 min為0%～63%B液；10～12 min為63%B液；12～17 min為100%B液；17～18 min為100%～0%B液；18～21 min為0%B液。衍生液于柱前自動衍生，激發波長為340 nm，發射波長為455 nm。

2.3 GABAa受體拮抗劑對CQ復方鎮痛作用的影響 按2.1項方法進行動物模型的制備，術后第2～7 d測評小鼠癌侵襲鏡像側后足的MWT，并將后3 d MWT均≤0.07 g的成模小鼠分為模型組，GABAa受體拮抗劑（Bic）+CQ組及單用CQ復方組（n=11）。Bic+CQ組在給予CQ復方前15 min，經尾靜脈注射Bic 2 mg·kg-1，以阻斷GABAa受體。CQ復方經腹腔注射給藥200 mg·kg-1。于Bic給藥前（即-15 min）、CQ復方給藥前（即0 min）及給藥后30，60，90，120，180，240 min，測評小鼠癌侵襲鏡像側后足的MWT，觀察GABAa受體阻斷對CQ復方鎮痛作用的影響。

2.4 脊髓組織內促炎性細胞因子含量的檢測 采用AimPlex流式高通量多因子檢測技術檢測脊髓組織內RANTES，MCP-3的含量，脊髓組織內細胞因子的含量需進一步按脊髓組織質量折算為每1 mg組織內的含量。連續給藥第3天，測得小鼠癌侵襲鏡像側后足的MWT后，取L3～L5段脊髓組織，稱重。按照相關試劑盒操作說明，制備樣品，將反應好的樣品通過流式細胞儀配備的488 nm激發光的PE通道進行熒光檢測上機讀數。結合抗原標準品的標準曲線，對脊髓組織內RANTES，MCP-3進行定量檢測。

2.5 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件，正態計量數據以±s表示，重復測量的MWT資料在具體某一時間點的組間比較采用多因素方差分析；對于檢測指標的數據采用獨立樣本t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CIIMIP模型小鼠鏡像側后足的MWT變化 術后2～7 d連續評價Native組、Sham組及Surgery組小鼠癌侵襲鏡像側的MWT，發現Surgery組小鼠MWT在術后第2天下降，第4～7天均穩定維持在（0.042±0.013）～（0.072±0.037）g，顯著低于Sham組和Native組（P<0.01），見圖1，且Surgery組小鼠癌侵襲側存在明顯的痛敏現象。術后第11天解剖，發現Surgery組小鼠腿部腫瘤位于坐骨神經分支處，腫瘤生長進行性地壓迫或侵襲坐骨神經，且該組小鼠左前肢和腹部在術前及術后16 d內均未見明顯疼痛表現，表明S180肉瘤細胞所致的癌侵襲痛模型小鼠存在鏡像痛現象。

3.2 CQ復方對CIIMIP模型小鼠鏡像側后足MWT的影響 連續第3天給藥前后各組小鼠后足MWT測評結果見表1。CIIMIP模型小鼠鏡像側的MWT在所有時間點與Native和Sham組比較均顯著降低（P<0.01）。H-CQ組的MWT在所有時間點與Model組比較均明顯提高（P<0.01，P<0.05），M-CQ組的MWT從給藥60 min開始與Model組比較均存在統計學意義（P<0.05），結果表明CQ復方對CIIMIP模型小鼠具有明顯鎮痛作用。

3.3 CIIMIP模型小鼠脊髓組織內EAA，IAA的含量以及CQ復方對其的影響 與Native組比較，Model組小鼠L3～L5段脊髓組織內興奮性氨基酸Glu的含量明顯升高（P<0.05），且CQ復方高、中、低劑量組能夠顯著降低模型小鼠脊髓組織內Glu的含量（P<0.01，P<0.05），并存在量效依賴關系，見表2。此外，與Native及Sham組比較，Model組小鼠脊髓組織內抑制性氨基酸GABA的含量均顯著降低（P<0.01），且CQ復方高劑量組能夠顯著提高模型小鼠脊髓組織內GABA的含量（P<0.01）；與Native及Sham組比較，Model組小鼠脊髓組織內抑制性氨基酸 Tau的含量均顯著降低（P<0.01），Model組小鼠脊髓組織內抑制性氨基酸Gly的水平明顯低于Sham組（P<0.05），且CQ復方高劑量組能夠顯著提高脊髓組織內Gly，Tau的含量（P<0.01），CQ復方中劑量組能夠明顯提高脊髓組織內Tau的含量（P<0.05），見表2。經統計，與Native及Sham組比較，Model組小鼠脊髓組織內Glu/GABA的比值顯著升高（P<0.01），且CQ復方高、中、低劑量組能夠顯著降低Glu/GABA的比值（P<0.01，P<0.05），見表2。

3.4 GABAa受體拮抗劑對CQ復方鎮痛作用的影響 Bic是GABAa受體競爭性拮抗劑。預先靜脈注射Bic，阻斷GABAa受體，在CQ復方給藥后180，240 min 2個時間點有意義地降低了CQ復方引起的MWT升高，與CQ組比較P<0.05，結果見圖2。提示CQ復方可能部分通過激活GABAa受體而發揮鎮痛作用。

4 討論

CQ復方具有活血行氣，祛風除濕，通絡止痛的功效，其主要成分為青藤堿和川芎嗪。青藤堿是中藥青風藤的主要成分之一，具有鎮痛、抑制免疫、抗炎等作用[10-11]。川芎嗪是中藥川芎的主要成分之一，具有鎮靜鎮痛、神經保護、抗血栓等活性[12]。本課題組前期已證實CQ復方對于三叉神經痛模型大鼠具有明顯的鎮痛效應[8]。而本文通過對MWT的測評，進一步發現CQ復方對于CIIMIP模型小鼠同樣具有顯著的鎮痛作用（P<0.01，P<0.05），為了更清楚地認識CQ復方對其的鎮痛活性，檢測了相關氨基酸類神經遞質、促炎性細胞因子在中樞神經系統中脊髓組織內的水平變化，并探討了其可能的作用靶點。

目前，被廣泛接受的鏡像痛形成機制主要有三大假說，分別是膠質細胞學說、神經學說、體液學說。其中，中樞神經系統膠質細胞激活，通過縫隙連接、鈣波及促炎性細胞因子的釋放參與鏡像痛發生的膠質細胞學說在鏡像痛發生機制中受到越來越多的關注[13-16]。

中樞神經系統內廣泛分布的氨基酸類神經遞質主要分為2類，一類是興奮性氨基酸包括Glu等，另一類是抑制性氨基酸包括GABA，Gly，Tau等。研究表明，在疼痛狀態下，過量的興奮性氨基酸Glu由初級傳入神經纖維末端釋放，激活脊髓背角神經元細胞膜上的NMDA受體，引起大量Ca2+內流，并以這種鈣波的形式，促使神經元發生去極化，產生痛覺過敏[17]。另有文獻報道，抑制性氨基酸GABA，Gly能夠與其相應受體結合，通過增加Cl離子向細胞內的流動，抑制脊髓背角介導的神經元興奮性反應以及疼痛信號的輸出[18]。此外，抑制性氨基酸Tau還可以通過直接作用于三叉神經脊束核尾側亞核膠狀質的突觸后神經元，活化GABA，Gly受體調節口面部疼痛[19]。作者檢測了CIIMIP模型小鼠L3～L5段脊髓組織內相關興奮性氨基酸和抑制性氨基酸神經遞質的含量，發現該模型小鼠脊髓組織內Glu的水平明顯升高（P<0.05），GABA，Gly，Tau的水平則顯著降低（P<0.01，P<0.05），而CQ復方可以逆轉上述情況的發生，顯著降低Glu/GABA比值（P<0.01，P<0.05），與上述研究的結果一致，提示了興奮性和抑制性氨基酸類神經遞質均參與CIIMIP的發生機制，CQ復方則可能通過對其的調控，調節中樞神經系統內EAA/IAA的平衡，發揮鎮痛作用。進一步通過觀察GABAa受體拮抗劑對CQ復方鎮痛作用的影響，發現預先使用GABAa受體拮抗劑一定程度地降低了CQ復方的鎮痛作用，表明CQ復方不僅在脊髓興奮性和抑制性氨基酸遞質水平發揮作用，而且可能部分通過激活GABAa受體介導其鎮痛作用的發揮。然而，CQ復方是否作用于GABA受體的其它亞型？是否作用于Glu受體以及具體作用于哪種亞型？尚需進一步深入研究。

促炎性細胞因子RANTES，MCP-3均屬于趨化因子中CC家族成員。文獻報道，敲除RANTES基因能減輕坐骨神經部分結扎誘導的痛覺過敏，抑制損傷神經中巨噬細胞浸潤，增加白細胞介素-4（IL-4），IL-10等抗炎因子的表達，從而參與神經病理性疼痛的調控[20]。另有報道，坐骨神經部分結扎可誘導脊髓星形膠質細胞MCP-3的表達提高，從而通過CC家族受體2（CCR2）參與痛覺傳遞[21]。本研究發現，CQ復方可以明顯降低模型小鼠脊髓組織內RANTES，MCP-3的水平（P<0.05）。提示CQ復方通過降低中樞神經系統內相關促炎性細胞因子的釋放，抑制疼痛信號的傳遞，這可能作為另一種途徑參與其鎮痛作用的機制。

本實驗中CQ復方對CIIMIP模型小鼠顯示了明顯的鎮痛作用及良好的量效依賴性，但對脊髓L3～L5節段內相關氨基酸類神經遞質和炎性細胞因子水平的影響，量效關系只出現了一定趨勢，線性不十分良好。其原因可能與實驗動物間的個體差異有關，也可能與實驗用藥為多成分藥物，其作用機制亦可能為多途徑、多環節、多靶點有關。故對上述檢測指標的相關因素及其更詳盡、深入的機制研究尚待開展。

綜上所述，本文通過建立CIIMIP小鼠模型，明確了CQ復方對CIIMIP的鎮痛作用，并觀察到此作用可能與調節中樞神經系統中脊髓組織內相關興奮性/抑制性氨基酸遞質的平衡，部分激活GABAa受體有關。同時，抑制相關促炎性細胞因子的釋放也是CQ復方發揮鎮痛作用的相關機制之一。該研究為CIIMIP相關發生機制的深入研究提供了參考，也為CQ復方應用于臨床治療癌癥侵襲鏡像痛提供了一定的藥理學依據。

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