瓜蔞薤白半夏湯對ApoE小鼠血脂代謝、氧化應激和主動脈Lox—1表達的影響

郭建恩+米樹斌+閆秀川+辛思源+高飛+梁廣和+李靜華

[摘要] 觀察瓜蔞薤白半夏湯（GXBD）在調節血脂代謝、抗氧化、干預ox-LDL/Lox-1通路的作用，探討其抗動脈粥樣硬化（AS）的作用機制。以高脂飼料飼喂雄性Apo-E-/-小鼠42只，建立AS模型。AS模型小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組、GXBD高、低劑量組，以C57BL/6J雄性小鼠作為正常對照組；每組10只，連續灌胃給藥8周。末次給藥后24 h，檢測血清TC，TG，LDL-C，HDL-C及SOD，MDA，GSH-px，ox-LDL水平；HE染色觀察主動脈組織結構變化，Western blot和PCR分別檢測主動脈Lox-1蛋白表達和mRNA水平。結果顯示模型組小鼠血脂指標含量及血清MDA，ox-LDL水平顯著高于正常對照組，SOD，GSH-px顯著低于正常對照組，主動脈Lox-1蛋白表達水平及其mRNA水平顯著高于正常對照組（P<0.05），模型組主動脈出現明顯粥樣硬化斑塊；GXBD高、低劑量組和辛伐他汀組小鼠血脂指標含量及MDA，ox-LDL水平顯著低于模型組，SOD，GSH-px顯著高于模型組，主動脈Lox-1蛋白表達水平及其mRNA水平顯著低于模型組（P<0.05），主動脈組織粥樣硬化病變明顯減輕。說明調節血脂代謝，抗氧化、抑制Lox-1的表達、干預ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的機制之一。

[關鍵詞] 瓜蔞薤白半夏湯； 動脈粥樣硬化； 抗氧化； 血脂； ox-LDL/Lox-1通路

[Abstract] To observe the functions of Gualou Xiebai Banxia decoction（GXBD） on regulating lipid metabolism， anti-oxidation， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway， and to explore its anti-atherosclerosis （AS） mechanisms. AS models were established by using 42 Apo-E-/- male mice with high fat diet. AS model mice were randomly divided into the model group， simvastatin group， and GXBD high and low dose groups. C57BL/6J male mice were used as the normal control group， n=10 and the treatment lasted for 8 weeks. The levels of TC， TG， LDL-C， HDL-C， SOD， MDA， GSH-px， and ox-LDL in blood serum were tested 24 h after the last administration. The changes of aortic tissues structure were observed by HE staining； the expression levels of Lox-1 protein and the expression levels of mRNA were detected by Western blot and PCR respectively.Results showed that the blood lipid levels and MDA， ox-LDL levels in blood serum of model group were significantly higher than those in the normal control group， but SOD， GSH-px levels were significantly lower than those in the normal control group， and the Lox-1 protein and mRNA expression levels were also significantly higher than those in the control group（P<0.05）， namely aortic atherosclerosis lesions were obvious in model group.The levels of blood lipid and MDA， ox-LDL of GXBD high and low dose groups and simvastatin group were significantly lower than those in model group， while SOD， GSH-px levels were significantly higher than those in model group， and Lox-1 protein and mRNA expression levels were significantly lower than those in model group（P<0.05）， namely the aortic atherosclerosis lesions were significantly relieved. The above results indicated that GXBD was capable of modulating blood lipid， anti-oxidation， and inhibiting the expression of Lox-1， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway in the AS model Apo-E-/- mice， which may be one of the mechanisms of anti-atherosclerosis.

[Key words] Gualou Xiebai Banxia decoction； atherosclerosis； antioxidant； blood lipid； ox-LDL/Lox-1 pathway

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、心肌梗死及腦梗死等多種心腦血管病的主要病理基礎，是多種因素共同作用于不同環節的疾病[1]。脂質代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應等均不同程度參與了AS的病理過程，氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL）及其受體血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，Lox-1）是影響AS 早期發病的主要因素[2]。瓜蔞薤白半夏湯（GXBD）是張仲景在《金匱要略》中創立的治療胸痹（冠心?。┑闹絼?，現代臨床主要用于各種類型冠心?。o癥狀型、心絞痛型、心肌梗死型、心力衰竭型等）等缺血性心臟病的治療[3]。藥理研究證實，該方能夠抗冠脈痙攣、擴張冠狀動脈、保護血管內皮、抑制心肌細胞凋亡等，部分揭示了該方保護缺血心肌的機制[4-6]。但是，在該方調節血脂方面作用尚存爭議[7]，對抗氧化作用尚有不同意見[8]，保護血管內皮機制尚不完全清楚，且尚未見到該方通過抗AS機制進而抗心肌缺血的報道。本研究擬對GXBD調節血脂、抗氧化及干預 ox-LDL/Lox-1信號通路的作用進行研究，揭示該方通過以上機制抗早期AS的作用，為該方臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 藥品 瓜蔞薤白半夏湯：全瓜蔞12 g，薤白9 g，半夏12 g，黃酒（適量）。薤白顆粒（河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，批號110102）；瓜蔞顆粒（河北安國振宇藥業有限公司，批號130301）；半夏顆粒（河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，批號110903）；辛伐他汀片（涿州東樂制藥有限公司，國藥準字號H20083227）。

1.2 動物 SPF級Apo-E-/-雄性小鼠42只，6～8周齡，體重18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK（京）2012-0001。SPF級雄性C57BL/6J小鼠12只，6～8周齡，體重18～20 g，實驗動物許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.3 儀器 ESJ200-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；日立7180全自動生化分析儀（日本日立株式會社）；D-37520高速冷凍離心機（sorvall公司）；Multiskan MK3酶標儀（芬蘭Thermo公司）；Rotor-gene 3000 Real-time PCR儀，Cycler PCR儀（Bio-Rad公司）；TE 77 PWR干轉儀（Amersham Bioscience公司）；復日FR-980生物電泳圖像分析系統、復日Smart view生物電電泳圖像分析軟件（上海復日科技有限公司）；Western電泳系統（164-5051，Bio-Rad公司）；PCR擴增儀（美國PE公司）；彩色病理圖像分析系統（日本Olympus公司）。

1.4 試劑 高脂飼料（配方：1%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、10%蛋黃粉和78.5%基礎飼料，批號20150612，北京科澳協力飼料有限公司）；總膽固醇（TC）試劑盒，批號637456- 01，甘油三脂（TG），批號638873-01，以上試劑由日本日立株式會社生產；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒，批號分別為020307，2400507，以上試劑生產廠家為北京利德曼生化股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（WST-1法），貨號A001-3，南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）測試盒，貨號A001-3，南京建成生物工程研究所；微量還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（微量酶標法），貨號A006-2，南京建成生物工程研究所；小鼠氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒，貨號20150716，廈門慧嘉生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，Amersham Bioscience公司產品；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），Bio-Rad公司；40% Acrylamide/Bis solution，Bio-Rad公司產品；化學熒光增強試劑盒（lumin enhanced chemiluminecent kit），BCA protein assay kit，ThermoFisher公司產品；蛋白Marker，Famentas公司產品；醫用X光膠片（12.7 cm×18.7 cm），購自上?？逻_膠片有限公司；Lox-1抗體購自美國Santa Cruz公司?？俁NA抽提試劑盒，RNeasy Mini Kit，QIAGEN公司產品；cDNA合成試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit， Fermentas 公司；SYBR Green PCR 試劑，SYBR Premix Ex TaqTM，Takara公司產品；無水乙醇，分析純，異丙醇，分析純；引物由TaKaRa公司設計并合成鑒定。

2 方法

2.1 藥液制備 取瓜蔞顆粒12 g，薤白顆粒9 g，半夏顆粒12 g，以上藥物與200 mL黃酒混勻，煎煮過濾合并藥液，減壓濃縮至含生藥1 g·mL-1。辛伐他汀以蒸餾水配制成1 g·L-1溶液。

2.2 AS模型建立 Apo-E-/-雄性42只、C57BL/6J小鼠12只，適應喂養1周，Apo-E-/-雄性小鼠飼喂高脂飼料（60Co γ滅菌照射處理），C57BL/6J小鼠喂飼普通飼料。8周后，隨機解剖Apo-E-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各2 只，眼眶取血，3 000 r·min-1離心10 min，檢測血脂水平，取小鼠主動脈，HE染色觀察主動脈組織結構，確定模型成功建立。

2.3 分組及給藥 C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組（NS）；制備成功的40只AS模型小鼠隨機分為模型組（MS）、辛伐他汀組（XFTT，5 mg·kg-1）和GXBD-Ⅰ（20 g·kg-1），GXBD-Ⅱ（10 g·kg-1）組，每組10只。給藥組按上述劑量灌胃（ig）給藥，給藥體積20 mL·kg-1；正常對照組及模型組ig等體積的生理鹽水，每日1次，連續8周。

2.4 標本獲取及處理 末次給藥后24 h，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，眼眶靜脈取血，分離血清，-20 ℃保存用于血清學分析。取血后開胸剝離主動脈全長（從主動脈弓起始到腹主動脈分叉處），生理鹽水沖洗后，用于常規形態學檢測；其余標本-80 ℃保存，Western blot和RT-PCR法檢測組織Lox-1蛋白及其mRNA表達水平。

2.5 小鼠血清血脂指標和氧化應激指標的檢測 應用全自動生化分析儀檢測各組動物血脂指標TC，TG，LDL-C，HDL-C，氧化應激指標SOD，MDA，GSH-px及ox-LDL水平，按產品說明書要求操作。

2.6 小鼠主動脈粥樣斑塊病理檢測 取主動脈弓部5 mm放入10%甲醛固定，常規乙醇脫水、石蠟包埋、切片，用于常規病理檢查。

2.7 小鼠主動脈Lox-1蛋白表達測定 取100 mg主動脈組織，提取總蛋白，制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，對處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉膜70 min，將膜取出，麗春紅染色，水洗脫色后，5%脫脂奶粉TBST液封閉，室溫震蕩1 h，棄封閉液，加入一抗Lox-1（1∶1 000）稀釋液孵育，4 ℃過夜，TTBS洗5 min，3次，然后根據一抗的性質加入相應辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液孵育，室溫震蕩1 h，TTBS洗5 min，3次，除去未結合的二抗，加發光液，曝光。應用復日FR-980生物電泳圖像分析系統分析底片中目的條帶，并分析條帶密度值。作為內參照。每個實驗重復3批以上不同樣本。

2.8 Real-time PCR測定主動脈Lox-1 mRNA表達 按照QIAGEN公司RNeazy Mini Kit說明提取主動脈組織總RNA，酶標儀檢測260 nm和280 nm波長吸光度，以計算A260/A280估計RNA純度（正常值1.8～2.0），質量濃度=A260×40×100（稀釋倍數）（g·mL-1）。在冰浴的無核酸酶的離心管中加入反應混合物進行逆轉錄反應。于PCR反應管中加入反應混合物進行Real-time PCR：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL（Lox-1上游引物5′-ACGGTTCTCCTTTGATGC-3′，下游引物5′-CTCTTAGGTTTGCCTTCTTC-3′；GAPDH上游引物5′-GGCATTGTGGAAGGGCTC-3′，下游引物5′-GACCTTGCCCACAGCCTT-3′），模板cDNA 1 μL、去離子水7 μL；反應條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s，40個循環進行擴增。

2.9 數據處理 使用SPSS 17.0數據處理軟件包進行統計學分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 t 檢驗，以 P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠血清血脂水平的影響 模型組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組（P<0.05）。各給藥組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組（P<0.05），見表1。

3.2 瓜蔞薤白半夏湯對Apo-E-/-小鼠SOD，GSH-px，MDA，ox-LDL的影響 模型組小鼠血清SOD，GSH-px水平低于對照組，MDA，ox-LDL含量高于對照組（P<0.05）。各給藥組小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型組，MDA，ox-LDL含量低于模型組（P<0.05），見表2。

3.3 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠主動脈Lox-1蛋白及mRNA表達的影響 模型組主動脈組織中Lox-1蛋白表達水平高于對照組（P<0.05）。各給藥組主動脈組織中Lox-1蛋白表達低于模型組（P<0.05）。各給藥組主動脈組織中Lox-1 mRNA表達低于模型對照組（P<0.05），見圖1，表3。

3.4 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠主動脈組織形態學的影響 對照組：動脈內膜完整且平滑，動脈內膜表面的內皮細胞呈褶皺狀均勻排列；模型組：血管內壁有殘損，管腔出現粥樣硬化斑塊，斑塊表面可見由大量膠原纖維以及少量的平滑肌纖維帽，斑塊內脂質含量豐富，纖維帽下方散在大量泡沫細胞和一些炎細胞[9]；GXBD低劑量組：血管內壁偶有殘損，血管腔可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積較模型組小，脂質含量也較模型組少，斑塊內可見少量泡沫細胞及炎性細胞；GXBD高劑量組及他汀組：血管內壁較為光滑，偶見內膜殘損，偶見泡沫細胞聚集和炎細胞浸潤，見圖2。

4 討論

中醫無AS一說，據其臨床表現，多與中醫之“胸痹”、“真心痛”、“中風”、“眩暈”、“頭痛”等病證相聯系，痰濁是AS發病的主要病理因素之一[9]?！督饏T要略》認為，胸痹之病機為“陽微陰弦”，胸陽不足、痰濁水濕痹阻，表現為喘息咳唾，胸背痛，短氣等，治以宣痹通陽。瓜蔞薤白半夏湯為治療“胸痹不得臥，心痛徹背”為主要表現的方劑，由全瓜蔞、薤白、半夏、白酒（低度米釀酒）組成，具有行氣解郁，通陽散結，祛痰寬胸之效?，F代藥理研究顯示，該方可通過降低CK，LDH，調解Bcl-2，Box 蛋白表達，抑制炎癥信號通路NF-κB、誘導提高JAK-STAT信號通路表達，干預（IL）-1β，IL-6，IL-10基因表達等多方面保護缺血心肌[10-12]。但是，現代臨床多將本方用于無癥狀型、心絞痛型等冠心病的治療[3]，而冠心病的病理基礎為AS，故從本方抗AS機制入手進行研究，更能揭示該方抗心肌缺血的機制，更接近于臨床應用之實際。

脂質代謝異常、氧化應激（OS）是早期AS重要的危險因素[13]。在長期HLP的情況下，增高的脂蛋白和膽固醇可對動脈內膜造成功能性和結構性損傷，盧志順等[14]研究證實，血漿中游離膽固醇達到一定濃度時，可引起內皮細胞膜結構的改變。同時，正常機體內活性氧的生成和清除處于一種動態平衡，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等是維持體內氧化與抗氧化平衡的重要活性物質。在氧化平衡被打破的情況下，脂質發生過氧化，產生毒性代謝終產物如丙二醛（MDA），能破壞細胞結構及功能，導致局部血管病理損傷和血管機能異常。另外，通過損傷的內皮細胞滲透進入動脈內膜下的LDL，在氧自由基（ROS）氧化修飾下變為ox-LDL。目前認為，ox-LDL具有細胞毒性作用，能夠誘發動脈內皮功能和結構的損傷，在動脈粥樣硬化發生、發展中起到重要作用[15]。以上多個環節共同造成了動脈內皮功能和結構的持續性損傷。

Lox-1是一種在內皮細胞豐富表達的Ⅱ型單鏈跨膜蛋白，可以結合、吞噬并降解ox-LDL，是介導血管內皮細胞攝取ox-LDL的主要受體之一。研究發現[16]，Lox-1結合ox-LDL后可迅速誘發內皮細胞ROS升高，特別是超氧陰離子和H2O2顯著升高，升高的ROS除作為第二信使外，還直接作用于內皮細胞，使NO失活和NF-κB活化，胞膜脂質過氧化[12，17]。而ox-LDL通過Lox-1與血管內皮細胞相互作用，引起如前所述的內皮細胞損傷及內皮功能障礙，是觸發AS病理過程的重要因素。同時，Lox-1尚可激活許多信號轉導途徑，參與AS病理的進展過程。因此，調節血脂代謝、抗氧化、調節Lox-1表達水平都是AS治療中的重要環節。

本研究以Apo-E小鼠復制AS病理模型，觀察GXBD對AS小鼠血脂代謝、氧化應激、血管內皮功能等的影響。研究結果顯示，GXBD各組和辛伐他汀組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平顯著低于模型組（P<0.05），HDL-C水平顯著高于模型組（P<0.05），說明GXBD可降低AS小鼠血脂水平。HE染色顯示GXBD各組和辛伐他汀組主動脈組織粥樣硬化病變較模型組減輕，說明GXBD可抑制AS小鼠動脈粥樣硬化形成，并且與辛伐他汀片療效相當。GXBD各組和辛伐他汀組小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型組（P<0.05），MDA，ox-LDL水平低于模型組，說明GXBD通過干預氧化應激分子水平，降低AS小鼠氧化應激反應。GXBD各組和辛伐他汀組小鼠主動脈Lox-1蛋白及其mRNA表達低于模型對照組（P<0.05），說明GXBD可以通過干預Lox-1表達，降低氧化應激對AS小鼠的影響，從而改善AS小鼠血管內皮功能。綜上所述，瓜蔞薤白半夏湯能夠調節AS小鼠血脂代謝、抗氧化、干預ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的部分機制。

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