基于中藥藥效物質“敲出/敲入”辨識模式篩選植物化感物質的思考

傅靖+張寶+劉紅燕+李明杰+古力+李娟+王豐青+張重義

[摘要] 該文闡述了植物化感作用的概念、特征及其與其連作障礙危害形成間的關系，并結合課題組前期的研究成果，指出精準鑒別化感物質并驗證其生態功能是破解植物連作障礙問題的關鍵。同時，針對化感物質分離鑒定中的難題，借鑒中藥藥效物質的研究方法，運用目標成分“敲出/敲入”的中藥藥效物質辨識與質量控制模式，提出了分離鑒定植物化感物質（群）的新思路和新方法。旨在為深化植物化感作用研究和消減中藥材生產中連作障礙問題提供理論依據和技術支撐。

[關鍵詞] 中藥材； 連作障礙； 化感物質篩選； 藥效辨識模式

[Abstract] This paper clarified in detail the definition， characteristics of allelopathy and its association with consecutive monoculture problem.Most of studies have indicated that it is critical to parse the formation mechanisms of consecutive monoculture problem that identification of allelochemicals and verification of its function. Here， we proposed a new approach to separate and identify the allelochemical group precisely and effectively， in which the "knock-out/in" methods of targeting ingredients in the model of medicinal effect identification and quality control were applied. This method will contribute to deep understanding plant allelopathy， and provide theoretical basis and technical support for alleviating consecutive monoculture problems simultaneously.

[Key words] Chinese medicinal material； consecutive monoculture problem； screening of allelochemicals； identification model of target components

化感作用（allelopathy）源于希臘語“Allelon（相互）和“elona（忍受痛苦）”。1984年Rice[1]在《Allelopathy》第2版中對其概念進行了補充和完善，化感作用即植物或微生物的代謝分泌物對環境中其他植物或微生物的有利或不利的作用，而對應的代謝分泌物我們稱之為化感物質，化感作用正是通過化感物質的化學生態學行為而呈現出來的。眾所周知，探討環境與生物之間的相互作用是生態學研究的核心，更是化學生態學研究的熱點問題，旨在揭示化學物質在有機體種內或種間以及與環境之間的媒介作用及其作用規律。因此，對化感物質的認識及研究有助于闡明生物體與周圍復雜環境（尤其是生物環境）之間的深層關系。但是由于化感物質的交互作用、劑量效應等，使得化感物質的分離和鑒定成為研究化感作用無法回避的科學問題[2]。本文提出了基于目標成分“敲出”的藥效辨識模式的方法用以篩選植物化感物質，為探明化感物質在植物有機體種內或種間的媒介作用奠定基礎并提供科學依據。

1 化感物質篩選是破解中藥材生產中連作障礙難題的關鍵

1.1 中藥材生產中連作障礙的現狀 連作障礙（consecutive monoculture problem）或稱重茬問題（replant problem & replant disease），是指在正常的管理措施下，同一塊地連續多年種植相同作物造成作物產量降低、品質變劣、生育狀況變差、病蟲害頻發的現象[3]。這一問題廣泛存在于農業生產中，而中藥材生產中表現尤為突出。據統計約占70%以上的根部（或根）入藥的藥用植物都存在不同程度的連作障礙，如連作地黃表現為植株生長不良，塊根不能正常膨大，產量和品質明顯下降，甚至絕收，而且每茬收獲后須隔8～10年后方可再種[3]，人參、西洋參、三七和當歸等連作障礙問題同樣突出[4-6]。 因此，連作障礙問題研究業已成為當今中藥農業可持續發展的戰略性課題，也是當前藥用植物資源生態學亟待解決的重要內容，成為國內外同行研究的熱點[7，11-13]。

1.2 化感物質的介導是藥用植物連作障礙形成的主要原因 前期研究表明，中藥材生產中的連作障礙問題其成因極其復雜，它涉及土壤理化性質改變、植物體養分吸收受阻、根際微生物群落結構失衡以及植物化感毒害作用等多個方面[7-10]?？傊?，連作條件下各因素間協同互作造成的根際微生態環境惡化是植物連作障礙形成的重要原因。而越來越多的研究提示化感物質可能是造成植物毒害及土壤微生態環境惡化的“元兇”[14-22]。

化感物質（allelochemicals）是指植物所產生的影響其他生物生長、行為和種群生物學的化學物質，不僅包括植物間的化學作用物，也包括植物和動物間的化學作用物[23]。它主要通過植物地上部分的淋洗和揮發、根的分泌以及植物殘體的分解等途徑向生態系統中釋放，從而影響周圍或后茬植物的生長發育[24]。目前，已在地黃、丹參、人參等藥用植物的組織和根系分泌物中分離出苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸等10多種化感自毒物質，這些物質通過影響離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質和DNA合成以及基因的表達與調控等多種途徑來影響植物生長[6-7，15]。

化感物質不僅對其他植物甚至自身產生毒害作用，還很容易擴散到環境中，改變根際土壤理化性質，進而影響土壤環境的微生態結構。以往對人參、西洋參、地黃、當歸、三七等忌連作藥用植物的研究表明，植物殘茬或根系分泌物均具有不同程度的化感自毒作用，這些化感物質或直接對后茬植物產生影響，或通過破壞土壤中的微生物群落結構引起植物根際微生態環境惡化[16-18]。本課題組前期研究證實，太子參連作障礙的發生與化感物質介導下根際微生態環境惡化相關[19]。事實上，形成藥用植物連作障礙的因素間還存在協同作用，且土壤微生物與化感作用物質間存在著拮抗和促進作用均已被證實，有些微生物能通過改變化感作用物質的數量和種類來影響化感作用，反之，化感物質也同樣能改變土壤微生物區系[15，20-23]。本課題組前期研究結果也顯示太子參連作后土壤酸化、pH降低，速效氮、鉀、磷含量降低，微量元素缺失，根際土壤真菌、放線菌、厭氣性纖維素分解菌等致病菌數量增加，細菌和好氣性自生固氮菌顯著下降[19]，最終導致土壤微生態環境惡化，引起太子參抗性降低、病變、畸形等癥狀。因此，精確鑒別植物化感物質，深入研究化感作用，詳細解讀化感物質介導根際微環境惡化的深層機制，對于揭示連作模式下植物-土壤-微生物系統復雜的生理生化過程，消減中藥材和其他作物的連作障礙問題具有重要指導意義。

1.3 植物化感物質的分離鑒定成為揭示其連作障礙成因的技術難點 對化感物質進行提取分離及鑒定是正確、全面認識化感現象的前提，亦是解讀連作障礙成因，消減連作障礙問題的關鍵所在?；诨形镔|作用的多種途徑，常采用夾層、常溫吸附、浸提或腐解和疏水性根滲出液連續收集等方法進行提取，后用萃取、樹脂和色譜等方法對其進一步分離純化[25]?，F代化學分析技術的進步為化感物質的分離鑒定提供了強有力的技術支持，利用氣相色譜（GC）技術、高效液相色譜（HPLC）技術和氣相-質譜聯用（GC-MS）、液相-質譜聯用（HPLC-MS）技術研究化感物質取得了很大的進展，尤其是液質聯用與氣質聯用兩種技術已成鑒定化感物質的主要方法。游佩進[26]采用HPLC-MS從連作三七土壤醇提液乙酸乙酯萃取層中鑒定出三七皂苷-G，同時他還利用 HPLC指紋圖譜比對法從三七根區土壤和根中鑒定出一個共有化合物人參皂苷-Rh1。但由于液質聯用沒有專業的圖譜庫，分析比較困難，氣質聯用是目前公認的鑒定能力較強的方法之一[27]。張新慧等[8]采用GC-MS技術從當歸根際土壤中獲得了包括有機酸、酮、醛、酯和烴類等在內的17種化感物質。宋宇加[28]采用GC-MS對種植人參后土壤3種不同極性有機溶劑提取液進行測試，結果發現，辛酸是人參產生的重要化感成分之一；2-甲基戊醛、2-甲基-己烯醛、7-十六烯醛、8-十五酮和十三碳酸甲酯有可能是人參所特有的化感物質，但尚未進一步被辨識和篩選。然而，GC-MS技術只能分析熱穩定且能氣化的20%左右的有機物，使得其在化感物質分離分析中的應用大大受限[29]。

目前，化感物質的研究多為從植物中分離到的單體或幾種成分的組合在較高濃度下對受試植物的生物測試。這種評價方法不能反應出自然界的真實情況，難以客觀體現植物化感作用是多種化感物質多途徑、協同作用的特點。由此，我們認識到探討一條既快又準鎖定發揮化感作用的主要物質，又能辨識化感物質互作關系的新途徑，進而篩選出目標關鍵物，已成為解讀連作障礙成因的關鍵環節和突破點。

2 目標成分“敲出/敲入”的藥效辨識模式研究的啟示

2.1 目標成分“敲出/敲入”的藥效辨識模式的提出 基于目標成分“敲出/敲入”的中藥藥效物質辨識與質量控制模式，借鑒“基因診斷治療”策略，強調中藥的整體性，以中藥“譜-效”關系為切入點，提出和論證基于目標成分敲出/敲入的中藥“譜-效”關系與“量效”關系研究模式，以目標成分“敲出”研究辨析中藥關鍵藥效組分及其相互作用關系，可實現質控指標“找得準，測得準”，是藥效物質識別與質量標準控制研究的新突破[30]。目前，已形成的較為成熟的敲出方法有薄層色譜法、液相色譜法、凝膠色譜法及超臨界萃取法等[31-36]。Kong等[37]利用薄層色譜技術從牛黃中敲出了6種單一或混合組分，進一步抗菌實驗研究表明6種組分間存在強烈拮抗作用，拮抗率達81.13%。李興豐[32]、何靜[36]對中藥姜黃抗氧化藥效物質識別與質量控制研究亦進一步證實“敲出”提取法是研究篩選中藥藥效成分的理想方法，驗證了基于目標成分“敲出”策略進行中藥關鍵藥效物質辨識具有可行性?；凶饔檬嵌喾N化感物質共同作用于生物體的復雜體系，與復雜方藥作用于人體的多靶點、多途徑、多效應整合調控模式相吻合。因此，借鑒中藥藥效物質的研究方法，對植物化感物質（群）進行研究切實可行。

2.2 中藥藥效辨識模式研究與化感作用的物質基礎研究具有相似性 迄今，對化感物質的研究或是從植物中得到混合物，但具體起作用的化學成分，尤其特有的化感物質尚不明確；或是以單個化感物質為研究對象，均忽視了化感物質間的相互作用?！敖M分中藥”的提出，在一定程度上將中藥多成分的復雜性問題簡易化，為闡明植物化感自毒作用物質基礎帶來了契機[38]。在自然狀態下，多種來源的化感物質間形成了復雜有序的互作關系，這與中藥組分的理念相吻合。這里的“組分”是由一類理化性質和藥理活性相似的成分按照一定比例，有機組合而成的具有完整結構和藥理活性的單位，通過系統化的篩選方法，得到的可以表達中藥整體的“中藥組分”[39-40]。當然，中藥組分理論的發展也有其相應的標準和范式，首先它應該基于中藥整體性之上，其藥效物質基礎具有一定可識別性。其次，中藥組分在組分間存在著復雜的配伍配比關系。最后中藥組分應是具有完整結構和藥理活性的單元。而基于目標成分的“敲出/敲入”策略恰恰吻合了方藥作用的整體性，其目標成分的“譜-效”關系研究始終圍繞方藥整體性開展，“敲出”的目標成分是具有完整結構和藥理活性的單元，體現了中醫藥整體觀、系統觀的特點和優勢。植物化感物質“組分”應是具有一定結構的內在有序整體，其研究思路主要是通過結合自毒試驗，篩選出合理的內部組分比，進而確定其組分結構。因此，基于目標成分的“敲出”策略能恰到好處地闡明中藥“組分”的物質基礎，而將其用于藥用植物化感自毒作用物質的識別與篩選是切實可行的。

2.3 目標成分“敲出/敲入”的藥效辨識模式的研究應用于化感物質篩選切實可行 當前，在中藥藥效物質與質量控制標準等研究領域內基于成分敲出/敲入的中藥藥效物質辨識與質量控制模式已被廣泛應用。例如，孔維軍等[31]通過敲出策略，初步實現人工牛黃抗真菌關鍵藥效物質的快速辨識；張甜甜[41]基于組分敲出/敲入的中藥組分辨識模式，結合金銀花臨床主要功效選用生物熱力學抗菌模型和抗腸道病毒EV71的細胞病變模型為篩選模型對金銀花關鍵藥效物質進行辨識，又快又準地確定金銀花抗菌抗病毒關鍵藥效組分——異綠原酸。

至今，連作障礙問題嚴重影響中藥藥效物質與質量控制標準，作物連作障礙的形成及加重的原因復雜多樣，各因素之間相互關聯、相互影響，是植物和土壤系統內多種因素相互綜合作用的結果。目前的研究普遍認為土壤理化性質的改變、微生物種群的變化和植物化感自毒作用是導致藥用植物連作效應的主要因素，其中對于化感物質的篩選是解除植物連作障礙的關鍵[42]。通過基于目標成分“敲出/敲入”的中藥藥效辨識模式研究方法，對植物化感物質進行篩選是借鑒基于成分敲出/敲入的中藥藥效物質辨識與質量控制模式而形成的一種新興技術，能夠為又快又準地鎖定化感物質組分、尋找主成份提供具有前瞻性、創新性和實用性的研究思路和方法體系。

3 展望

借助于其他學科的新理論新技術，使研究不斷深入并得以突破?；诖?，明確植物化感自毒物質種類及互作關系是進一步揭示植物化感自毒物質的生物合成與釋放途徑、探討環境因子對植物化感自毒作用影響的基礎，同時也是探明植物連作障礙成因，解讀其化感自毒作用機制的關鍵所在。而探明植物化感物質種類首先要搞清植物忌連作如此突出是否與其含有特殊的化感物質有關系。此外，這些化感物質中哪些起主要作用，哪些起輔助作用，以及他們的協同關系等均不清楚，因此明確其組成、互作方式、量效關系及化學生態學行為等，對于進一步研究連作介導的根際土壤環境災變機制與控制新策略具有重要作用，對于進一步揭示生態環境中生物體種間及種內的復雜相互關系具有重大指導意義。

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