LC-MS-MS法同時測定人血漿中阿戈美拉汀及其2種代謝產物的濃度

曹 媛

LC-MS-MS法同時測定人血漿中阿戈美拉汀及其2種代謝產物的濃度

曹 媛

目的 建立同時測定人血漿中阿戈美拉汀及其代謝產物7-去甲阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀濃度的方法。方法 采用LC-MS/MS法(液相色譜串聯質譜)進行檢測，以非那西汀為內標、Phenomenex ODS-3為色譜柱，A(0.2%甲酸銨+100%水)-B(甲醇)=30∶70為流動相進行色譜分離。采用ESI(電噴霧電離源)和MRM(多反應監測)的方式進行正電荷檢測，用作定量分析的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和非那西汀的離子反應對m/z分別為244.1→185.1、230.1→171.1、260.1→201.1、180.1→110.1。結果 阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀分別在0.045 7～100 ng/mL、0.137 2～300 ng/mL、0.457 2～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好；最低檢測限分別為0.045 7、0.137 2、0.457 2 ng/mL；所有待測樣本的日內及日間精密度和準確度均符合相關生物樣品分析的要求，且RSD<10%。在穩定性試驗中，血漿樣品在室溫放置4 h、在4 ℃放置24 h、經歷3 次冷凍-解凍循環及在-80 ℃中放置3個月等條件下均可保持穩定。結論 該方法具有操作簡便、檢測快速及靈敏性好等特點，能夠用于臨床相關藥動學研究。

阿戈美拉??；7-去甲阿戈美拉??；3-羥基-阿戈美拉??；液相色譜串聯質譜法；血藥濃度

0 引言

阿戈美拉汀是第一個褪黑素受體激動劑類抗抑郁藥物[1-2]，主要用于抗焦慮、抗抑郁、調節生物鐘及調整睡眠節律等[3]，對于重度抑郁癥患者，阿戈美拉汀的抗抑郁效果明顯優于經典抗抑郁藥物氟西汀[4-5]，由于該藥物的不良反應較少，因此可能成為一種應用廣泛的抗抑郁藥物。目前，臨床針對該藥物及其代謝產物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀LC-MS/MS的研究較少，對阿戈美拉汀的藥代動力學研究亦不多見，而上述代謝產物同樣具有較強的抗焦慮與調整睡眠等藥理活性，3-羥基-阿戈美拉汀還能夠抗精神失常[6]，故對其藥動學研究具有十分重要的意義。因此，本試驗建立了同時檢測阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的LC-MS/MS方法，此方法的通用性較強，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器 5415R型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；LC-20AD型高效液相色譜儀(HPLC，日本島津公司)；Techne氮吹儀(英國Techne有限公司)；API3200串聯三重四極桿質譜儀(MS/MS，美國應用生物系統有限公司)。

1.2 藥品及試劑 阿戈美拉汀(純度99.7%，批號：98140302)、3-羥基-阿戈美拉汀(純度99.4%，批號：98150104)、7-去甲-阿戈美拉汀(純度99.1%，批號：98150317)，法國Les Laboratoires Servier公司；非那西汀(中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號：2015090133)作為本研究的內標；色譜甲醇(美國天地有限公司，批號：15040261)。其他試劑均為分析純?；瘜W結構見圖1。

圖1 阿戈美拉汀(A)、3-羥基-阿戈美拉汀(B)、7-去甲-阿戈

2 方法與結果

2.1 色譜條件與質譜條件 色譜條件：以Phenomenex ODS-3 (150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex有限公司)為色譜柱，A (0.2%甲酸銨+100%水)-B (甲醇)=30∶70為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。進樣方式為自動進樣。質譜條件：電噴霧電離源(ESI)，檢測為正電荷模式，多反應監測(MRM)。電壓：4 000 V；用于定量的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和非那西汀的離子反應對m/z分別為244.1 → 185.1、230.1 →171.1,260.1 → 201.1，180.1 → 110.1；去簇電壓(DP)分別為90、50、50、70 V，入口電壓(EP)分別為3.5、8、10、7 V，碰撞能量(CE)分別為10、10、15、20 eV。

2.2 對照品溶液的配制 將分析物阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內標非那西汀用甲醇配成1.0 mg/mL的儲備液并保存于-80 ℃冰箱。對照品儲備液的制備：取上述1.0 mg/mL的儲備液，加甲醇至阿戈美拉汀質量濃度分別為1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372、0.457 2 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質量濃度分別為3 000、1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質量濃度分別為10 000、3 333、1 111、370.4、123.5、41.15、13.72、4.572 ng/mL的混合儲備液。內標儲備液質量濃度為100 ng/mL。

2.3 血漿樣品處理 精密移取200 μL人體血漿置于1.5 mL規格的離心管中，精密加入20 μL焦亞硫酸鈉溶液(20 g/L)后渦旋混合30 s；再加入30 μL內標液(100 ng/mL)，渦旋混合30 s；于4 ℃條件下，添加600 μL 15%的鹽酸甲醇溶液，渦旋混合5 min；處理后的血漿在12 000 r/min 條件下高速離心(15 700 ×g)10 min，吸取上清液5 μL進行LC-MS/MS分析。

2.4 方法學專屬性的考察 在優化之后的色譜和質譜條件下，分別得到空白血漿(圖2A)、對照品血漿(圖2B)和受試者血漿(圖2C)的典型色譜圖，見圖2。阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內標非那西汀的保留時間分別為5.5、3.4、3.1、3.1 min，液質圖峰形良好，血漿中存在的內源性物質不干擾阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內標的測定。

2.5 標準曲線及最低定量限(LLOQ)的考察 收集不含待測物及內標的血漿，分別配制同時含有阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀3種藥物的對照品血漿，其中阿戈美拉汀質量濃度分別為1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372、0.457 2 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質量濃度分別為3 000、1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115及1.372 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質量濃度分別為10 000、3 333、1 111、370.4、123.5、41.15、13.72及4.572 ng/mL，并根據“2.3”項中相關方法對處理后的樣品進行進樣測定。

以阿戈美拉汀和內標的峰面積比值(R1)為縱坐標，以其濃度(c1)為橫坐標，計算阿戈美拉汀在血漿中的標準曲線，得其直線回歸方程：Y=0.118 8 X-0.000 5 (r2=0.996 2)；以7-去甲-阿戈美拉汀和內標的峰面積比值(R2)為縱坐標，以其濃度(c2)為橫坐標，計算7-去甲-阿戈美拉汀在血漿中的標準曲線，得其直線回歸方程：Y=0.073 4 X-0.000 3 (r2=0.997 5)；以3-羥基-阿戈美拉汀和內標的峰面積比值(R3)為縱坐標，以其濃度(c3)為橫坐標，計算3-羥基-阿戈美拉汀在血漿中的標準曲線，得其直線回歸方程：Y=0.054 3 X-0.000 7(r2=0.997 8)；結果表明，阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的LLOQ分別為0.457 2、1.372、4.572 ng/mL，其分別在0.045 7～100 ng/mL、0.137 2～300 ng/mL及0.457 2～1 000 ng/mL范圍內線性關系良好。

注：A.空白血漿，B.空白血漿+0.045 7 μg/L阿戈美拉汀+0.137 2 μg/mL 7-去甲-阿戈美拉汀+0.457 2 μg/mL 3-羥基-阿戈美拉

2.6 精密度及準確度試驗 取200 μL空白血漿，根據“2.2”項和“2.3”項方法配制成低、中、高濃度梯度的QC樣品(阿戈美拉汀質量濃度分別為0.109 7、3.704、80 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質量濃度分別為0.329 2、11.11、240 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質量濃度分別為1.097、37.04、800 ng/mL)，各個濃度均分別進行5樣本分析且均連續測定3 d。按照當日所測得的標準曲線計算血漿中阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀及3-羥基-阿戈美拉汀的日內精密度，并根據上述方法，在不同的日期重復操作另外樣品，計算日間精密度。結果見表1。

表1 精密度和準確度結果

2.7 提取回收率和基質效應 取空白血漿，按照“2.3”項中方法處理后，分別加入“2.6”項低、中、高濃度的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀，分別取10 μL進樣。分別用2種方法處理不同濃度各種化合物，取其峰面積的比值，計算各種化合物的提取回收率(n=5)。結果顯示，低、中、高濃度阿戈美拉汀回收率分別為88.5%、87.7%、90.7%；7-去甲-阿戈美拉汀回收率分別為99.5%、91.4%、95.3%；3-羥基-阿戈美拉汀回收率分別為104.6%、99.9%、100.3%。結果表明，3種藥物的回收率均符合要求且穩定。

另取200 μL健康志愿者的空白血漿，按照“2.3”項中方法處理后，分別加入低、中、高質量濃度的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀20 μL及內標20 μL，對上述樣品均進行LC-MS/MS 分析并獲得峰面積，與直接進樣的相同濃度混合標準品溶液得到的峰面積相互比較，并考察本研究中的基質效應。結果顯示，低、中、高濃度阿戈美拉汀基質效應分別為112.1%、102.7%、107.5%；7-去甲-阿戈美拉汀基質效應分別為107.0%、103.3%、108.0%；3-羥基-阿戈美拉汀基質效應分別為104.6%、110.1%、111.7%。內標的平均基質效應為105.3%。結果表明，3種藥物在本檢測方法下均不存在基質效應。

2.8 穩定性試驗 在不同的保存條件下，對阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的低、中、高質量濃度血漿樣品的穩定性進行考察(n=5)，各次檢測結果的RSD均<15%。結果顯示，三種血漿樣品于室溫中放置4 h、在4 ℃的進樣溫度下放置24 h、在3次冷凍-解凍循環處理及在-80 ℃的保存條件中保存3個月后均穩定。結果見表2。

表2 穩定性試驗結果(ng/mL，n=5)

2.9 藥動學試驗 20名中國籍漢族健康志愿者(18～26歲)于試驗日晨，在空腹條件下用100 mL溫水送服阿戈美拉汀片(1片，25 mg)；受試者于給藥前0 h及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8 h時，采集各志愿者靜脈血1 mL。將上述取得的血漿樣本分別置于肝素管中，用冰浴冷卻后，以5 000 r/min的離心條件離心10 min，得到分離后的血漿并置于-80 ℃冰箱內保存待測。利用LC-MS/MS法檢測給藥后不同時間的阿戈美拉汀血藥濃度，利用DAS 2.1.1軟件對本研究中的藥-時數據進行統計學分析，并得到主要藥動學數據，包括峰值濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、所有時間點的曲線下面積(AUClast)、藥-時曲線下面積(AUCinf)及半衰期(t1/2)。見表3。阿戈美拉汀及其代謝產物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的藥-時曲線見圖3。本研究藥動學實驗得到我院倫理委員會批準，且各受試者均同意并簽署知情同意書。

表3 本研究中藥動學試驗主要參數(n=5)

圖3 阿戈美拉汀(A)、7-去甲-阿戈美拉汀(B)和3-羥基-阿戈美拉汀(C)的血漿藥-時曲線

3 討論

阿戈美拉汀是一種褪黑素類似物，是首個上市銷售的褪黑素受體激動劑，臨床試驗顯示，其對抑郁癥具有較好的療效[7]，不良反應亦較少[8]，可能成為一種應用廣泛的抗抑郁藥物。但臨床針對該藥物及其代謝產物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀LC-MS/MS的研究十分匱乏[9-12]。因此，建立準確且簡便的阿戈美拉汀血藥濃度測定方法具有非常重要的意義。沈陽藥科大學藥學院應用LC-MS/MS方法，測定了比格犬血漿中阿戈美拉汀的藥代動力學行為及其相對生物利用度，靈敏度較高，但是其為動物水平研究，與人體實際情況具有一定的差異，且其峰形較差，準確度不高[13]；尚德為等[14]建立了一種人血漿中阿戈美拉汀濃度的快速檢測方法，并對該藥物的2種片劑的生物等效性進行研究。盡管其對于阿戈美拉汀人體藥代動力學研究起到重要作用，但其未對該藥物的代謝產物進行同時檢測。

筆者為了同時檢測阿戈美拉汀及其代謝產物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的人體血漿含量，希望通過增加流動相中的質子供體來增強分離效果，因此液相條件選擇中初始選擇添加醋酸銨，但發現其對響應無明顯改善，因此，通過在流動相中添加0.2%甲酸銨，有效增強了分離度；此外，一般情況下，乙腈的洗脫能力明顯強于甲醇，但本研究中乙腈流動相的色譜峰形較差，且重復性不佳，選用甲醇后，發現分離效果較好，且無保留時間過長等問題。盡管本課題得到較為理想的檢測結果，但仍存在一些問題，主要在于本研究的阿戈美拉汀體內藥代動力學研究中，志愿者均選擇為中國籍漢族人群，但對于其余人種，該方法是否存在一定的影響還需要進一步考證。

綜上所述，本方法可應用于阿戈美拉汀及其代謝產物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的人體藥動學及生物等效性研究，對該藥物的應用及代謝的研究具有重要意義。

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Simultaneous determination of agomelatine and two of its metabolites in human plasma by LC-MS/MS

CAO Yuan

(Department of Pharmacy,Baoji People′s Hospital,Baoji 721000,China)

Objective To establish a method for the simultaneous determination of agomelatine,7-desmethyl-agomelatine and 3-hydroxy-agomelatine in human plasma.Methods The LC-MS/MS method was used with phenacetin as internal standard,and the determination was performed on Phenomenex ODS-3 column with 0.2% ammonium formate+100% water-methanol (30∶70) as the mobile phase.Agomelatine (244.1→185.1),7-desmethyl-agomelatine (260.1→201.1) and 3-hydroxy-agomelatine (180.1→110.1) were detected by electrospray ionization (ESI) with positive ion in MRM mode quantitatively.Results The linear range was good within 0.045 7～100 ng/mL of agomelatine,0.137 2～300 ng/mL of 7-desmethyl-agomelatine and 0.457 2～1 000 ng/mL of 3-hydroxy-agomelatine,respectively,and the lowest limits of quantitation were 0.045 7,0.137 2 and 0.457 2 ng/mL,respectively.The intra-day and inter-day precision and accuracy were all in line with the requirements of biological sample analysis.The plasma samples were stable after 3 freeze-thaw cycles and being stored for 4 h at room temperature and 90 d at -80 ℃.Conclusion The method is rapid,sensitive and repeatable,which can be used for the determination of plasma concentration and pharmacokinetic study.

Agomelatine;7-desmethyl-agomelatine;3-hydroxy-agomelatine;LC-MS/MS;Plasma concentration

2016-07-28

寶雞市人民醫院藥劑科，陜西 寶雞 721000

10.14053/j.cnki.ppcr.201703023