甲型流感病毒誘導急性呼吸窘迫綜合征的研究進展

何莎莎 趙京霞 徐霄龍 崔煦然 郭玉紅 劉清泉

(中醫感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫研究所，北京，100010)

甲型流感病毒誘導急性呼吸窘迫綜合征的研究進展

何莎莎 趙京霞 徐霄龍 崔煦然 郭玉紅 劉清泉

(中醫感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫研究所，北京，100010)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一個致命的甲型流感病毒感染并發癥。ARDS發生的一個主要原因是肺泡上皮-內皮屏障損傷。本綜述探討了肺泡上皮細胞、內皮細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞在甲型流感病毒誘導肺泡上皮-內皮屏障損傷中發揮的作用，為防治甲型流感誘導的ARDS提供理論依據。

急性呼吸窘迫綜合征；甲型流感病毒；肺泡上皮-內皮屏障

流感病毒是呼吸道感染的重要病原體，在全球范圍內呈年度內和年度間周期流行。1918年西班牙爆發的甲型H1N1流感在全球范圍內大流行造成超過4000萬人死亡[1]。2009年爆發的甲型H1N1流感在第一年傳播中造成了151 700～575 400人死亡[2]。由于新型甲流病毒(如禽源H5N1和H7N9病毒)能夠在人類獲得高效遺傳性，嚴重影響了全球人類的健康[3-4]。人感染甲型H1N1流感病毒后的主要臨床癥狀為急性呼吸道感染，部分患者會發展成急性肺損傷(ALI)，甚至更為嚴重的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。因此，深入了解甲型流感誘導ALI/ARDS的致病機制非常重要。

肺泡上皮-內皮屏障是由肺泡上皮細胞層、基膜和肺泡內皮細胞層形成的半選擇性通透屏障，可以調控液體及大分子物質的轉運，同時也是肺泡內氣體與血液內氣體分子交換的場所[5]。肺泡上皮-內皮屏障損傷會導致肺泡腔內出現大量含有纖維蛋白、紅細胞和炎性細胞的蛋白質水腫液，進一步導致肺泡氣體交換量減少，最終引起嚴重的呼吸衰竭，其中以ARDS患者最為明顯[6]。因此，為進一步明確甲型流感病毒誘發ARDS的致病機制，我們針對肺上皮細胞、內皮細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞在流感病毒誘導上皮-內皮屏障損傷過程中所發揮的作用進行探討，旨在進一步了解其致病機制，為臨床上防治流感病毒誘發ARDS提供理論依據。

1 肺泡上皮細胞

甲型H1N1流感病毒進入肺泡后首先感染的是肺泡上皮細胞[7]。肺泡上皮細胞包括I型和II型肺泡上皮細胞。I型肺泡上皮細胞為扁平細胞，約占肺泡表面積的95%，其主要作用是允許肺泡腔和毛細血管血液內的氣體交換。II型肺泡上皮細胞為立方形細胞，主要通過分泌表面活性劑減少肺表面張力。緊密連接將相鄰的肺泡上皮細胞聯系在一起，其主要功能是調節細胞旁通透性和確保屏障的完整性。緊密連接由跨膜蛋白、胞質蛋白和細胞骨架蛋白構成，Claudins、occludin是緊密連接的主要跨膜蛋白，ZO-1、ZO-2、ZO-3是主要胞質蛋白，其將跨膜蛋白和細胞骨架蛋白連接在一起[8]。超過90%的跨肺泡上皮-內皮屏障的蛋白質轉運阻力都來自于肺泡上皮細胞[9]。因此，維持肺泡上皮細胞屏障滲透壓，限制蛋白質轉運，能夠有效地防止肺水腫。

肺泡上皮細胞維持肺泡腔內無流液的第二種機制是通過離子通道和膜蛋白作用，其中包括阿米洛利敏感性上皮鈉通道(ENaC)，囊性纖維細胞跨膜傳導調節因子和許多不同的水通道蛋白。在肺中最具特征離子通道是ENaC，其存在于I型和II型肺上皮細胞的頂面。肺泡腔Na+通過肺泡上皮細胞頂面的ENaC進入肺泡上皮細胞，再由基底膜的鈉泵(Na+-K+-ATPase)排出到肺循環中，同時伴隨水的被動吸收，防止肺水腫的發生[10-11]。

肺泡上皮細胞不僅是上皮-內皮屏障的重要組成部分，還是甲型流感病毒感染的主要靶細胞。甲型流感病毒通過將病毒血凝素連接到細胞表面上的唾液糖上而結合其靶細胞。不同的肺泡上皮細胞的唾液糖表達存在差異：I型肺泡上皮細胞主要表達α-2,6-連接的唾液酸糖，通常人流感病毒優選，而II型肺肺泡上皮細胞主要表達α-2,3連接的唾液酸糖，通常由禽類優選[12-13]。死于H5N1流感病毒的患者的尸體解剖顯示H5N1病毒抗原是最突出的II型肺泡上皮細胞，與禽流感病毒對α-2,3連接的唾液酸糖趨向性一致[14]。

肺泡上皮細胞在甲型流感病毒感染誘導ARDS病理過程中發揮的作用如下：1)甲型流感病毒直接抑制肺泡上皮細胞鈉離子通道(ENaCs)的鈉離子轉運，降低肺泡液體清除能力，導致肺泡腔液體聚集[10，15]。2)誘導肺泡上皮細胞凋亡和壞死，破壞上皮細胞層完整性，損傷上皮-內皮屏障[16]。3)誘導上皮細胞產生大量細胞因子(CCL2，CCL5，CXCL8，CXCL10，IL-6，IL-8，TNF-α)[17-18]，促進肺內皮細胞黏附分子表達上調，損傷上皮-內皮屏障[19]。4)上皮細胞損傷和細胞因子的產生會破壞上皮細胞間緊密連接[20]，同時一些H5N1流感病毒菌株感染也能直接破壞細胞間連接[21]，使得屏障通透性增加。最終，上述變化導致的肺泡內蛋白質液體聚集成為ARDS的病理基礎。

2 肺微血管內皮細胞

肺微血管內皮細胞是肺臟中最豐富的細胞類型，占細胞總量的30%。在肺泡中，內皮細胞在肺泡壁中形成毛細血管網絡。在內皮細胞頂側，與循環血液直接接觸，形成招募炎性細胞的附著環境。適當激活后，內皮細胞表達細胞黏附分子，其結合到它們在白細胞上的同源配體并介導白細胞外滲[22]。在細胞基底側，內皮細胞與上皮細胞基底膜緊密接觸甚至融合[23]，這種緊密接觸表明內皮細胞很大程度受到從肺泡上皮細胞和肺泡腔中的炎性細胞釋放的信號(IFN-β-TRAIL、Stat1、HGF/c-Met、TGF-α/EGFR)和病毒顆粒(H1N1、H5N1、H7N9)的影響[24-26]。這些信號和病毒顆粒誘導內皮細胞激活對于介導對抗甲型流感的有效免疫應答是必須的。然而，內皮細胞的過度激活也會誘導上皮-內皮屏障損傷和促進肺水腫。

內皮細胞在甲型流感病毒感染誘導ARDS病理過程中發揮的作用如下：1)流感病毒感染激活內皮細胞，誘導黏附分子(E-選擇素、P-選擇素、ICAM1、VCAM1)表達上調，從而招募白細胞進入肺泡[27-28]，大量嗜中性粒細胞和巨噬細胞的存在可通過各種機制誘導肺泡上皮-內皮屏障損傷[29]。2)誘導內皮細胞產生“細胞因子風暴”(CCL2，CCL5，CXCL2，CXCL10，IL-1α，IL-6，IFN-γ)[30]，過量的細胞因子產生一方面能夠直接損傷內皮細胞，另一方面會招募嗜中性粒細胞和巨噬細胞誘導肺泡上皮-內皮屏障損傷[31-32]。3)甲型流感病毒能通過直接感染內皮細胞，誘導內皮細胞死亡，損傷肺上皮-內皮屏障，從而引發肺水腫[33]。由于內皮細胞僅構成跨上皮-內皮屏障蛋白質轉運的10%的阻力，因此，單獨的內皮細胞損傷不是肺水腫的關鍵原因，內皮細胞激活誘導的“細胞因子風暴”比內皮細胞直接感染對肺泡上皮-內皮屏障損傷更重要。

3 嗜中性粒細胞

嗜中性粒細胞在流感病毒感染24 h內從血液外滲至肺泡腔[29]。嗜中性粒細胞外滲具有以下幾個步驟：沿著內皮細胞滾動，附著到內皮細胞上的選擇蛋白和黏附素，通過內皮和上皮細胞層遷移到肺泡腔[34]。這種遷移可以導致上皮-內皮屏障暫時損傷，但不足以引起肺水腫。

嗜中性粒細胞在進入肺泡腔后，在局部存在的細胞因子和病原體刺激下而被激活?；罨氖戎行粤＜毎赏淌刹≡w，所得的吞噬體可與胞質內一級，二級和三級顆粒融合，其含有各種毒性化合物以殺死吞噬的病原體[35]。除了吞噬作用之外，嗜中性粒細胞可以通過形成嗜中性粒細胞胞外陷阱(組蛋白，染色質和抗微生物化合物組成的胞外DNA)來捕獲和殺死病原體[36]。

嗜中性粒細胞在甲型流感病毒感染誘導ARDS病理過程中發揮的作用如下：1)激活狀態下的嗜中性粒細胞在NADPH氧化酶的作用下能夠廣泛性產生活性氧(ROS)，ROS的產生不僅能殺死流感病毒等病原體，也會損傷肺泡和上皮-內皮屏障[37-38]。2)流感病毒感染觸發嗜中性粒細胞產生細胞因子(CXCL2，CXCL10，IL-8)，將大量的嗜中性粒細胞募集到感染部位，間接損傷上皮-內皮屏障[39]。3)流感病毒感染產生嗜中性粒細胞胞外陷阱，損傷上皮和內皮細胞，破壞上皮-內皮屏障[40]。

4 肺泡巨噬細胞

肺泡巨噬細胞與嗜中性粒細胞一樣，是機體對抗流感病毒感染的固有免疫應答的重要組成部分。肺泡巨噬細胞主要分布在肺泡腔肺泡膜表面的一層襯液中，其數量占肺泡常駐細胞的80%，是體內唯一能與空氣接觸的細胞群，組成肺組織的第一道防線。肺泡巨噬細胞能夠吞噬病原體、感染和凋亡細胞，然后通過呼吸爆發，產生活性氧物質和一氧化氮殺死吞噬的病原體[38]。巨噬細胞也可以產生廣泛的促炎性反應細胞因子和抗炎性反應細胞因子。在肺泡內有2種類型的巨噬細胞：第一種是常駐肺泡巨噬細胞，通常表達可選擇的活化表型使得對無害病原體的炎性反應最小化，同時保護肺部免受更強病原體的侵襲[41]。第二種類型的巨噬細胞是最近招募的巨噬細胞，通常具有經典激活表型，其在誘導肺泡上皮-內皮屏障的損傷中發揮重要作用。

巨噬細胞在甲型流感病毒感染誘導ARDS病理過程中發揮的作用如下：1)流感病毒感染誘導巨噬細胞表達腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)，其與死亡受體5(DR5)相互作用(DR5是流感病毒感染中在上皮細胞中上調的蛋白質)，誘導上皮細胞凋亡，損傷上皮-內皮屏障[25]。2)巨噬細胞在促炎因子刺激下誘導一氧化氮合酶(NOS2)表達，產生NO。NO與過氧化物結合形成過氧硝酸鹽，可以殺死病原體和損傷細胞，誘導肺損傷和高死亡率[42-43]。3)誘導大量的細胞因子產生(CCL2，CCL5，CXCL10，IFN-β，TNF-α，IL-6等)，損傷肺上皮-內皮屏障[44-46]。

5 結語

甲型流感病毒誘發ARDS的一個主要原因是損傷肺泡上皮-內皮屏障，以往有關ARDS損傷上皮-內皮屏障的認識大多來源于對細菌性敗血癥的研究，并且首先損傷的是內皮細胞。但這個模型并不適用于流感病毒，因為流感病毒首先感染的是上皮細胞。本綜述探討了肺泡上皮細胞、內皮細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞在甲型流感病毒誘導肺泡上皮-內皮屏障損傷中發揮的作用及其機制，為防治甲型H1N1流感病毒誘導ARDS提供理論依據。

[1]Johnson N P，Mueller J.Updating the accounts：global mortality of the 1918-1920 “Spanish” influenza pandemic[J].Bull Hist Med，2002,76(1):105-115.

[2]Dawood F S，Iuliano A D，Reed C，et al.Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation：a modelling study[J].Lancet Infect Dis，2012,12(9):687-695.

[3]Webster R G，Peiris M，Chen H，et al.H5N1 outbreaks and enzootic influenza[J].Emerg Infect Dis，2006,12(1):3-8.

[4]Horby P，Tatem A J，Huang Z，et al.H7N9 is a virus worth worrying about[J].Nature，2013,496(7446):399.

[5]Lucas R，Verin A D，Black S M，et al.Regulators of endothelial and epithelial barrier integrity and function in acute lung injury[J].Biochem Pharmacol，2009,77(12):1763-1772.

[6]Matthay M A，Ware L B，Zimmerman G A.The acute respiratory distress syndrome[J].J Clin Invest，2012,122(8):2731-2740.

[7]Short K R，Kasper J，van der Aa S，et al.Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions[J].Eur Respir J，2016,47(3):954-966.

[8]Koval M.Claudin heterogeneity and control of lung tight junctions[J].Annu Rev Physiol，2013,75:551-567.

[9]Gorin A B，Stewart P A.Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux[J].J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol，1979,47(6):1315-1324.

[10]Folkesson H G，Matthay M A.Alveolar epithelial ion and fluid transport：recent progress[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2006,35(1):10-19.

[11]Berthiaume Y，Matthay M A.Alveolar edema fluid clearance and acute lung injury[J].Respir Physiol Neurobiol，2007,159(3):350-359.

[12]Shinya K，Ebina M，Yamada S，et al.Avian flu：influenza virus receptors in the human airway[J].Nature，2006,440(7083):435-436.

[13]van Riel D，Munster V J，de Wit E，et al.H5N1 Virus Attachment to Lower Respiratory Tract[J].Science，2006,312(5772):399.

[14]Nakajima N，Van Tin N，Sato Y，et al.Pathological study of archival lung tissues from five fatal cases of avian H5N1 influenza in Vietnam[J].Mod Pathol，2013,26(3):357-369.

[15]Chen X J，Seth S，Yue G，et al.Influenza virus inhibits ENaC and lung fluid clearance[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004,287(2):L366-L373.

[16]Uiprasertkul M，Kitphati R，Puthavathana P，et al.Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A(H5N1)virus in humans[J].Emerg Infect Dis，2007,13(5):708-712.

[17]Chan M C，Cheung C Y，Chui W H，et al.Proinflammatory cytokine responses induced by influenza A(H5N1)viruses in primary human alveolar and bronchial epithelial cells[J].Respir Res，2005,6:135.

[18]Veckman V，Osterlund P，Fagerlund R，et al.TNF-alpha and IFN-alpha enhance influenza-A-virus-induced chemokine gene expression in human A549 lung epithelial cells[J].Virology，2006,345(1):96-104.

[19]Wyble C W，Hynes K L，Kuchibhotla J，et al.TNF-alpha and IL-1 upregulate membrane-bound and soluble E-selectin through a common pathway[J].J Surg Res，1997,73(2):107-112.

[20]Mullin J M，Snock K V.Effect of tumor necrosis factor on epithelial tight junctions and transepithelial permeability[J].Cancer Res，1990,50(7):2172-2176.

[21]Golebiewski L，Liu H，Javier R T，et al.The avian influenza virus NS1 ESEV PDZ binding motif associates with Dlg1 and Scribble to disrupt cellular tight junctions[J].J Virol，2011,85(20):10639-10648.

[22]Chen M，Geng J G.P-selectin mediates adhesion of leukocytes，platelets，and cancer cells in inflammation，thrombosis，and cancer growth and metastasis[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2006,54(2):75-84.

[23]Maina J N，West J B，Orgeig S，et al.Recent advances into understanding some aspects of the structure and function of mammalian and avian lungs[J].Physiol Biochem Zool，2010,83(5):792-807.

[24]Ito Y，Correll K，Zemans R L，et al.Influenza induces IL-8 and GM-CSF secretion by human alveolar epithelial cells through HGF/c-Met and TGF-alpha/EGFR signaling[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2015,308(11):L1178-L1188.

[25]Hogner K，Wolff T，Pleschka S，et al.Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia[J].PLoS Pathog，2013,9(2):e1003188.

[26]Ramana C V，DeBerge M P，Kumar A，et al.Inflammatory impact of IFN-gamma in CD8+T cell-mediated lung injury is mediated by both Stat1-dependent and-independent pathways[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2015,308(7):L650-L657.

[27]Zeng H，Pappas C，Belser J A，et al.Human pulmonary microvascular endothelial cells support productive replication of highly pathogenic avian influenza viruses：possible involvement in the pathogenesis of human H5N1 virus infection[J].J Virol，2012,86(2):667-678.

[28]Ocana-Macchi M，Bel M，Guzylack-Piriou L，et al.Hemagglutinin-dependent tropism of H5N1 avian influenza virus for human endothelial cells[J].J Virol，2009,83(24):12947-12955.

[29]Perrone L A，Plowden J K，Garcia-Sastre A，et al.H5N1 and 1918 pandemic influenza virus infection results in early and excessive infiltration of macrophages and neutrophils in the lungs of mice[J].PLoS Pathog，2008,4(8):e1000115.

[30]Teijaro J R，Walsh K B，Cahalan S，et al.Endothelial cells are central orchestrators of cytokine amplification during influenza virus infection[J].Cell，2011,146(6):980-991.

[31]Armstrong S M，Darwish I，Lee W L.Endothelial activation and dysfunction in the pathogenesis of influenza A virus infection[J].Virulence，2013,4(6):537-542.

[32]Cheung C Y，Poon L L，Lau A S，et al.Induction of proinflammatory cytokines in human macrophages by influenza A(H5N1)viruses：a mechanism for the unusual severity of human disease[J].Lancet，2002,360(9348):1831-1837.

[33]Armstrong S M，Wang C，Tigdi J，et al.Influenza infects lung microvascular endothelium leading to microvascular leak：role of apoptosis and claudin-5[J].PLoS One，2012,7(10):e47323.

[34]Huber D，Balda M S，Matter K.Transepithelial migration of neutrophils[J].Invasion Metastasis，1998,18(2):70-80.

[35]Jaeschke H，Smith C W.Mechanisms of neutrophil-induced parenchymal cell injury[J].J Leukoc Biol，1997,61(6):647-653.

[36]von Kockritz-Blickwede M，Nizet V.Innate immunity turned inside-out：antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps[J].J Mol Med(Berl)，2009,87(8):775-783.

[37]Amulic B，Cazalet C，Hayes G L，et al.Neutrophil function：from mechanisms to disease[J].Annu Rev Immunol，2012,30:459-489.

[38]Fang F C.Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species：concepts and controversies[J].Nat Rev Microbiol，2004,2(10):820-832.

[39]Wang J P，Bowen G N，Padden C，et al.Toll-like receptor-mediated activation of neutrophils by influenza A virus[J].Blood，2008,112(5):2028-2034.

[40]Narasaraju T，Yang E，Samy R P，et al.Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis[J].Am J Pathol，2011,179(1):199-210.

[41]Holt P G.Down-regulation of immune responses in the lower respiratory tract：the role of alveolar macrophages[J].Clin Exp Immunol，1986,63(2):261-270.

[42]Perrone L A，Belser J A，Wadford D A，et al.Inducible nitric oxide contributes to viral pathogenesis following highly pathogenic influenza virus infection in mice[J].J Infect Dis，2013,207(10):1576-1584.

[43]Zablockiene B，Ambrozaitis A，Kacergius T，et al.Implication of nitric oxide in the pathogenesis of influenza virus infection[J].Biologija，2012，58(1):15-25.

[44]Osterlund P，Pirhonen J，Ikonen N，et al.Pandemic H1N1 2009 influenza A virus induces weak cytokine responses in human macrophages and dendritic cells and is highly sensitive to the antiviral actions of interferons[J].J Virol，2010,84(3):1414-1422.

[45]Yu W C，Chan R W，Wang J，et al.Viral replication and innate host responses in primary human alveolar epithelial cells and alveolar macrophages infected with influenza H5N1 and H1N1 viruses[J].J Virol，2011,85(14):6844-6855.

[46]Geiler J，Michaelis M，Sithisarn P，et al.Comparison of pro-inflammatory cytokine expression and cellular signal transduction in human macrophages infected with different influenza A viruses[J].Med Microbiol Immunol，2011,200(1):53-60.

(2017-03-17收稿 責任編輯：洪志強)

Research progress of influenza A virus-induced acute respiratory distress syndrome

He Shasha，Zhao Jingxia，Xu Xiaolong，Cui Xuran,Guo Yuhong，Liu Qingquan

(BeijingKeyLaboratoryofBasicResearchwithTraditionalChineseMedicineonInfectiousDiseases,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,Beijing100010,China)

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a fatal complication of influenza A virus infection. One of the main causes of ARDS is alveolar epithelial and endothelial barrier injury. The review discusses the role of pulmonary epithelial cells, endothelial cells, neutrophils, and macrophages in the pathogenesis of influenza A virus-induced alveolar epithelial and endothelial barrier injury, and provides a theoretical basis for the prevention and treatment of influenza A virus-induced ARDS.

Acute respiratory distress syndrome; Influenza A virus; Alveolar epithelial and endothelial barrier

北京市醫院管理局重點醫學專業發展計劃專項(編號：ZYLX201611)；北京市科委綠色通道專項項目(編號:Z141100006014056)

何莎莎(1990.03—)，女，博士，研究實習員，研究方向：黏膜免疫，E-mail：hss_sara@126.com

劉清泉(1965.11—)，男，大學本科，主任醫師/教授，首都醫科大學附屬北京中醫醫院院長，研究方向：中西醫結合診治危重病，E-mail:liuqingquan2003@126.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.004