瑤藥崗松抗佐劑性大鼠關節炎的實驗研究

趙會勤+李超杰+徐玉潔+賈奧+賈貝西+賈成軍

【摘要】目的：觀察瑤藥崗松根醇提物（BFTE）對大鼠佐劑性關節炎（AA）的藥理作用。方法：42只大鼠隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組及BFTE高、中、低劑量組，完全弗氏佐劑誘導AA后，于第12天開始連續灌胃給藥16d；同一時間點測定大鼠足趾腫脹度、關節炎評分、免疫器官指數；第29天處死大鼠，酶聯免疫法（ELISA）測定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，光學顯微鏡觀察大鼠踝關節的病理變化。結果：與模型組相比，BFTE能夠顯著抑制AA大鼠的原發性和繼發性足跖腫脹度，降低關節炎評分、免疫器官系數，改善大鼠踝關節病理狀態，下調AA大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。結論：BFTE對AA大鼠具有良好的治療作用，其抗炎免疫的機理可能與減少TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌有關。

【關鍵詞】瑤藥；崗松；類風濕關節炎；佐劑性關節炎；炎癥因子

【中圖分類號】R2827【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0037-05

桃金娘科植物崗松（Baeckea frutescens L）為廣西瑤族民間習用藥材，盤瑤語稱“樸老中”，產于我國的南部地區，全株均可入藥，具有化瘀止痛、清熱解毒、利尿通淋、殺蟲止癢的功效，臨床用于感冒高熱、黃疸型肝炎、胃痛、腸炎、風濕關節痛、腳氣病、膀胱炎、小便不利等[1-2]。目前，崗松資源的開發利用僅以地上部分（枝葉）所含揮發油為主，而對地下部分（根）的研究報道較少。課題組對崗松根進行了較為系統的化學研究，分離鑒定Baeckeins A-I共9個新化合物[3-6]，并進行初步的抗炎活性評價。本研究在前期基礎上，結合民間用藥習慣及文獻資料記載，擬對崗松根醇提物抗類風濕關節炎（RA）的藥理作用開展研究，并在細胞水平探討其可能的作用機制。

1材料與儀器

11實驗動物SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購自購自河南省實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（豫）2011-0001。

12藥品與試劑瑤藥崗松采自廣西南寧，經廣西民族醫藥研究院戴彬主任醫師鑒定為Baeckea frutescens L的根，經95%乙醇提取、回收溶劑得總浸膏（BFTE），使用時用05% CMC-Na溶液的配制成所需濃度。雷公藤多苷片（上海復旦復華藥業有限公司）；完全弗氏佐劑（CFA，美國Sigma公司）；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒和IL-1β ELISA 試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）；甲醛（天津市風船試劑科技有限公司）。

13儀器電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；外徑千分尺（Radio Shack Corporation）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；全自動酶標儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）。

2方法

21AA大鼠模型的制備及分組給藥從4 ℃冰箱中取出CFA，充分振蕩、混勻；將大鼠右后肢拉直，用75%的酒精消毒，使用l mL注射器于大鼠足跖皮內注射015 mL CFA致炎，正常對照組大鼠注射等體積的生理鹽水[7-9]。將42只大鼠隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、崗松根醇提物高（BFTE-H）、中（BFTE-M）、低（BFTE-L）劑量組，每組7只；于造模后第12天開始灌胃給藥，連續給藥16 d；雷公藤多苷組給予雷公藤多苷10 mg/kg，BFTE-H、BFTE-M、BFTE-L組分別給予BFTE 60、30、15 g生藥/kg/d，正常組及模型組給予等量的05% CMC-Na溶液。

22足趾腫脹度于造模前及造模后12、24、36、48h用電子游標卡尺測量大鼠右后足跖厚度，以致炎前后的差值作為大鼠的足趾腫脹度（即足趾腫脹度=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度）[10-11]，以后每4 d測量一次（即4、8、12、16、20、24、28d），觀察AA大鼠原發性和繼發性足跖腫脹。

23關節炎指數大鼠炎癥出現后，每隔4d觀察并記錄病變程度。病變程度按5級評分法評價：0分-無紅腫，1分-關節有紅色斑點或輕度腫脹，2分-關節中度紅腫，3分-關節重度紅腫，4分-關節嚴重腫脹并伴有功能障礙；累計大鼠各個關節的評分和即為關節炎指數，每只大鼠最多評16分[12]。

24細胞因子大鼠繼續給藥至28d，禁食但不禁水12 h，于第29天稱量各組大鼠的體重，用20%烏拉坦（20g/100 mL）腹腔注射麻醉（06mL/100g），腹主動脈取血，凝血后離心分離血清，按照試劑盒說明，采用ELISA法分別測定TNF-α、IL-6、IL-1β的含量[13]。

25免疫器官系數于第29d大鼠取血后，摘除胸腺和脾，用生理鹽水沖洗后，用濾紙吸除多余的水分，電子天平稱重，計算胸腺和脾臟指數（臟器指數=臟器重量（mg）/體重（g））[14]。

26病理切片第29天處死各組大鼠，取下包括踝關節在內的整個右足爪，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，使用10%EDTA脫鈣完全后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）[15]，在高倍顯微鏡下觀察大鼠踝關節的病理變化。

27統計方法數據采用SPSS190軟件進行分析，計量資料以均數加減標準差（x±s）表示，多個樣本比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統計學意義。

3結果與討論

31BFTE對AA大鼠原發性足趾腫脹的影響與正常組相比，各組大鼠右側足跖腫脹明顯（P< 001），除正常組以外的其它各組間大鼠足跖腫脹無統計學差異，顯示造模成功（見表1）。于造模第12天開始灌胃給藥，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組在給藥12d和16d（即造模24d和28d）后能有效減輕大鼠原發足跖腫脹程度；造模28d時，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H和BFTE-L組有統計學差異（P<005），BFTE-M組有顯著統計學差異（P<001）；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組無統計學差異（P>005），而BFTE各劑量組間也無統計學差異（P>005）（表2）。由此可見，BFTE能夠顯著降低AA大鼠原發性足趾腫脹，BFTE-M組效果最好。

32BFTE對AA大鼠繼發性足趾腫脹的影響除正常組外的各組大鼠，于造模后第12天出現繼發性左后足跖腫脹，第16天達到高峰。與正常組相比，第12天開始各組大鼠均出現明顯的足跖腫脹（P<005）；給藥12d（即造模24d）后，雷公藤多苷組和BFTE各劑量組能夠顯著降低AA大鼠繼發性足趾腫脹程度（P<005）；給藥16d（即造模28d）后，各給藥組大鼠繼發性足趾腫脹程度繼續降低，與模型組相比，均具有極顯著統計學差異（P<001）；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無統計學差異（P>005），而BFTE各組間也無統計學差異（P>005）。表明BFTE對AA大鼠繼發性足趾腫脹具有顯著的抑制作用，且BFTE-M組作用最強。見表3。

33BFTE對AA大鼠關節炎指數的影響模型組大鼠于造模12h后原發側足跖急速腫脹，關節炎指數升至3左右；8d后腫脹向膝關節蔓延，關節炎指數升至4左右；12d繼發側足跖開始出現腫脹，且大鼠前趾也開始出現紅腫，關節炎指數有大幅度提升；隨病程延長，關節炎指數持續升高，24d達到高峰。20d時各給藥組大鼠的原發側和繼發側足跖腫脹開始降低，前爪足趾紅腫也有所減輕；28d時，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組具有極顯著統計學差異（P<001），而與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無統計學差異（P>005），表明BFTE能顯著改善AA大鼠的關節炎癥狀。見表4。

34BFTE對AA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著增高（P<001）；與模型組相比，BFTE各劑量組對AA大鼠血清中的IL-1β和IL-6均具有極顯著的抑制作用（P<001），BFTE-M和BFTE-L組對TNF-α也具有顯著作用（P<005）；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H和BFTE-M組對大鼠血清中IL-1β的抑制作用顯著（P<005）（見表5）。由此可見，BFTE在降低AA大鼠血清中的IL-1β方面更為突出，其作用優于陽性藥雷公藤多苷，且量效關系明顯。

35BFTE對AA大鼠免疫器官系數的影響與正常組相比，模型組大鼠的脾系數和胸腺系數均顯著升高（P<005）；與模型組相比，BFTE-M和BFTE-L組的脾系數和胸腺系數有統計學差異（P<005），而BFTE-H組無統計學差異（P>005）；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組均無統計學差異（P>005）。表明BFTE對AA大鼠免疫器官具有保護作用，但BFTE-L組效果較好。見表6。

36BFTE對AA大鼠踝關節病理變化的影響大鼠踝關節病理檢查顯示：正常組大鼠滑膜上皮規整、單層排列，軟骨光滑清晰，關節腔內清晰、無炎性細胞浸潤；模型組大鼠滑膜有組織增生和炎性細胞的滋潤，且軟骨有一定的剝落；給予雷公藤多苷或不同劑量的BFTE治療后，大鼠的滑膜組織增生、軟骨破壞及炎性細胞浸潤均有不同程度的減輕。見圖1。

4討論

佐劑性關節炎大鼠是一種免疫性炎癥模型，是篩選和評價抗風濕藥常用的模型之一，其發病機制和病理表現與人類類風濕性關節炎類似；該模型造模簡單易行、周期短、重復性好，被認為是研究類風濕性關節炎最為理想的模型之一。研究表明，炎性細胞因子在RA發病過程中起重要作用，尤其是參與炎癥的全過程，加重炎性反應；TNF-α與IL-1β是促炎性細胞因子，常同時合成分泌，被稱為姊妹細胞因子；TNF-α刺激IL-6和IL-1β的釋放，致使炎癥反應加重，并且能促進滑膜及內皮細胞成纖維細胞因子的產生，破壞滑膜細胞和軟骨細胞，引起滑膜增生、軟骨的破壞；IL-1β誘導TNF-α和IL-6的表達，促進滑膜細胞、軟骨細胞的增值，致使關節損壞；IL-6不僅增強 IL-1β和TNF-α的效應，還能促進類風濕因子的合成。

本研究基于AA大鼠模型，對瑤藥崗松根的醇提物進行抗風濕活性評價，結果表明，崗松根能夠顯著減輕AA大鼠的原發性和繼發性足趾腫脹度，降低關節炎指數、保護免疫器官，改善大鼠踝關節的病理狀態，下調AA大鼠血清中炎癥因子水平，顯示出良好的抗炎免疫作用，并呈現出一定的量效關系，其作用機制可能調節機體免疫功能、減少IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌；本研究通過整體動物實驗驗證了崗松根的抗風濕效用，該研究可為瑤藥崗松的資源開發和臨床應用提供科學依據。

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