藥物處理對失眠癥斑馬魚睡眠的影響以及相關作用機制

何東方，張麗軍，劉梅顏

· 論著 ·

藥物處理對失眠癥斑馬魚睡眠的影響以及相關作用機制

何東方1，張麗軍1，劉梅顏1

目的 觀察藥物處理對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用，并探討銀杏葉滴丸（GBP）對γ-氨基丁酸A型受體α1亞單位（GABRA1）和褪黑素受體1類亞型（MTNR1）mRNA表達的影響。方法 采用咖啡因誘導活體斑馬魚建立失眠模型，分別水溶給予GBP（低劑量組56 μg/mL、中劑量組167 μg/mL、高劑量組500 μg/mL）、金納多（Ginaton，低劑量組56 μg/mL、中劑量組167 μg/mL、高劑量組500 μg/mL）和氯化鋰（陽性對照組，500 μM），同時設置正常對照組和失眠組，應用行為分析儀定量斑馬魚處于失眠狀態的時間，評價GBP對斑馬魚睡眠的改善作用。另取失眠模型斑馬魚，水溶給予GBP 56、167、500 μg/mL，同時設置正常對照組和失眠組，采用RT-PCR檢測GABRA1和MTNR1 mRNA的相對表達量。結果 在觀察的1 h（3600 s）內，失眠組斑馬魚失眠時間多于正常對照組，（1598 ±277）s vs.（1240 ±129）s，差異有統計學意義（P＜0.01）。陽性對照組斑馬魚失眠時間為（1368±170）s，少于失眠組，差異有統計學意義（P＜0.05）。低劑量、中劑量、高劑量的GBP對睡眠的改善作用分別為72%、95%和97%。低劑量、中劑量、高劑量的Ginaton對睡眠的改善作用分別為78%、80%和95%。與正常對照組比較，GBP低劑量組GABRA1 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；失眠組、GBP中劑量組和高劑量組無明顯變化，差異無統計學意義（P均＞0.05）；與失眠組比較，GBP低劑量組GABRA1 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。MTNR1 mRNA相對表達量：與正常對照組比較，失眠組、GBP低劑量組和高劑量組降低，差異有統計學意義（P均＜0.01），GBP中劑量組無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與失眠組比較，GBP低劑量組、中劑量組和高劑量組均升高，差異有統計學意義（P均＜0.01）。結論 低、中、高濃度銀杏葉滴丸和金納多對失眠癥斑馬魚睡眠均有顯著改善作用；銀杏葉滴丸改善睡眠的可能機制為抑制GABRA1的表達和改善MTNR1的表達。

斑馬魚；失眠；抑郁；γ-氨基丁酸A型受體；褪黑素受體

抑郁是一種心境障礙，與正常的悲傷情緒密切相關[1]。抑郁表現為顯著且持續的情緒失落、活動力明顯減退、思維及認知能力遲緩等，同時還會導致一些精神生理的變化，如睡眠及食欲的紊亂，影響到患者的工作與生活，嚴重者甚至會有自殺傾向[2-4]。抑郁的發生及復發率很高，其發病年齡也十分寬泛[5]，抑郁患者常伴有頑固性睡眠障礙，表現為失眠、入睡困難、早醒、睡眠節律紊亂、睡眠質量差等[2,6]。有研究表明[7]，睡眠障礙是抑郁癥的伴隨癥狀，睡眠問題已經作為抑郁癥的診斷標準之一，同時睡眠質量也是評價治療效果的指標之一。

斑馬魚是一種具有多重優點的模式脊椎動物，與人類基因組相似度高達87%，在神經系統、心血管系統和腎臟系統等方面都與人類具有相似的發育機制與特點[8]。近年來斑馬魚已被越來越多地應用于生物醫學研究，如建立人類疾病模型、進行藥理毒理實驗、篩選藥物[9]。目前己有大量研究觀察抗焦慮藥、鎮靜藥、抗抑郁藥等作用于神經系統的藥物及小分子化合物對斑馬魚成魚的影響[10-12]，同時也有研究觀察評價斑馬魚睡眠模型[13-15]。

金納多為一種國際標準銀杏葉提取物，有大量文獻證實其對抑郁、焦慮、失眠等精神類疾病具有一定的治療作用[16-18]。而國內的銀杏葉提取物與金納多相比在提取工藝上存在很大差別，故國內外的銀杏葉提取物并不能完全等同來看。國內各廠家生產的銀杏葉制劑也不完全相同[19]，銀杏葉滴丸（GBP）是各類銀杏葉制劑中的獨家劑型，鮮有報道其在抗抑郁、改善睡眠質量方面的作用。本實驗采用咖啡因誘導斑馬魚造成失眠模型，給予GBP和Ginaton治療，從行為學角度考察GBP對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用。在抗抑郁、焦慮、失眠等機制的研究中，γ-氨基丁酸A（GABAA）受體和褪黑素（Mt）受體的相關靶點不斷受到關注[20-23]。故從銀杏葉滴丸對γ-氨基丁酸A型受體α1亞單位（GABRA1）和褪黑素受體1類亞型（MTNR1）mRNA相對水平的影響來探討其抗抑郁、改善睡眠的生物靶點及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用斑馬魚品系為野生型AB系斑馬魚，參照Westerfield的養殖方法[24]，飼養于杭州環特生物科技有限公司斑馬魚實驗室［SYXK（浙）2012-0171］，該斑馬魚研究平臺符合AAALAC國際認證的要求。斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。共900尾，年齡為受精后1天（1 dpf），后續實驗中選用5 dpf的斑馬魚，飼養于28℃的養魚水中。因為胚胎可以從自身的卵黃囊中獲取營養物質，所以在9 dpf內不需要喂食。

1.2 實驗藥物與儀器試劑

1.2.1 實驗藥物 銀杏葉滴丸（萬邦德制藥集團股份有限公司）、金納多（德國威瑪舒培博士大藥廠）、咖啡因（阿拉丁試劑上海有限公司）、氯化鋰（LiCl，阿拉丁試劑上海有限公司）。使用前將銀杏葉滴丸、咖啡因和金納多用100%的二甲基亞砜（DMSO）配置成濃度為50 mM的母液，備用；將LiCl用超純水配置成濃度為50 mM的母液，備用。

1.2.2 儀器試劑 解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon）、96孔板（Nest Biotech）、行為分析儀（V3，View Point Life Sciences）、PCR擴增儀（Bioer）、超微量分光光度計（Thermo）、水平電泳儀（北京六一）、凝膠成像系統（培清）、6孔板（Nest Biotech）、ReverTra Are-α-反轉錄試劑盒（TOYOBO）、2×PCR MasterMix（BioTeKe）、DL2,000 DNA Marker（TAKARA）、TRI reagent（Invitrogen）、DEPC水（生工生物）。

1.3 方法

1.3.1 失眠斑馬魚模型制備和分組 選取5 dpf野生型AB系斑馬魚，在解剖顯微鏡下挑選發育正常的斑馬魚，不同分組與處理：正常對照組，正常飼養，未處理；失眠組，用咖啡因（200 μM）做誘導劑處理斑馬魚24 h；GBP治療組，用咖啡因和GBP同時水溶給樣方式處理斑馬魚24 h；Ginaton治療組，用咖啡因和Ginaton同時水溶給樣方式處理斑馬魚24 h；陽性對照組，用咖啡因和氯化鋰（500 μM）同時水溶給樣方式處理斑馬魚24 h。

1.3.2 確定藥物的最大耐受濃度（MTC） 隨機選取480尾斑馬魚于6孔板中，分為16個實驗組，每組各30尾。即正常對照組、失眠組、GBP治療組、Ginaton治療組，按不同的濃度各分為7組，GBP的濃度分別為：25、50、100、250、500、1000和2000 μg/ml，Ginaton的濃度分別為：25、50、100、250、500、1000和2000 μg/ml。24 h后，觀察斑馬魚反應情況，并統計各實驗組的死亡數量與毒性情況，確定兩種藥物的MTC。

1.3.3 評價藥物對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用依據1.3.2的結果得到GBP和Ginaton的MTC，選取各自的MTC、1/3 MTC和1/9 MTC分別設為高劑量組、中劑量組和低劑量組。同時設置正常對照組、失眠組和陽性對照組，共計9個組別，每組均30尾斑馬魚，在28℃培養箱中孵育。24 h后，每個實驗組隨機選擇10尾斑馬魚，應用行為分析儀定量斑馬魚處于失眠狀態的時間（T）。失眠狀態為斑馬魚處于黑暗環境中的靜止狀態，失眠時間即處于靜止狀態的時間，觀察時間為1 h。藥物對失眠癥斑馬魚睡眠改善的計算公式如下：

1.3.4 GBP對GABRA1和MTNR1 mRNA相對表達水平的影響 各組取30尾藥物干預24 h后的AB系斑馬魚，用柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，擴增生成cDNA。GABRA1上游引物序列：5'-ACCACAGTGTTCACCAGGAT T-3'，下游：5'-ACGCCCGAGTCTACGCT-3'；擴增片段大小572 bp。MTNR1上游引物序列：5'-CCCCTGGGTGGTGACTTT-3'，下游：5'-CGA TGGCGATGCCTGTAATG-3'；擴增片段大小302 bp。β-actin上游引物序列5'-CATCAGCATGGCT TCTGCTCTGTATGG-3'，下游：5'-GACTTGTCA GTGTACAGAGACACCCT-3'；擴增片段大小389 bp。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30 s，共36個循環，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結果，凝膠成像分析系統（JS-680D）進行掃描。分別測定GABRA1、MTNR1及β-actin的吸光度值。以β-actin作為內參基因，得到各組光密度數據，基因相對表達量計算公式如下：

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料以（±s）表示，組間資料比較用方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s T檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物的最大耐受濃度 GBP和Ginaton設置的濃度分別為：25、50、100、250、500、1000和2000 μg/ml，其中1000 μg/ml和2000 μg/ml濃度下斑馬魚全部死亡（表1）。故MTC確定為500 μg/ml，為高劑量組；1/3 MTC為167 μg/ml，為中劑量組；1/9 MTC為56 μg/ml，為低劑量組。

2.2 藥物對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用 在觀察的1 h（3600 s）內，失眠組斑馬魚失眠時間多于正常對照組，（1598 ±277）s vs. （1240 ± 129）s，差異有統計學意義（P＜0.01），表明模型建立成功。陽性對照組斑馬魚失眠時間為（1368±170）s，少于失眠組，差異有統計學意義（P＜0.05），睡眠改善作用為64%，表明LiCl對斑馬魚失眠癥具有明顯的改善作用。低劑量、中劑量、高劑量的GBP對睡眠的改善作用分別為72%、95%和97%。低劑量、中劑量、高劑量的Ginaton對睡眠的改善作用分別為78%、80%和95%（圖1～2）。

表1 藥物濃度反應情況

圖1 藥物對斑馬魚失眠時間的改善作用（與失眠組相比，aP＜0.05，bP＜0.01，各組n=10）

2.3 GBP對GABRA1和MTNR1 mRNA相對表達水平的影響 與正常對照組比較，GBP低劑量組GABRA1 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；失眠組、GBP中劑量組和高劑量組無明顯變化，差異無統計學意義（P均＞0.05）；與失眠組比較，GBP低劑量組GABRA1 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖3）。MTNR1 mRNA相對表達量：與正常對照組比較，失眠組、GBP低劑量組和高劑量組降低，差異有統計學意義（P均＜0.01），GBP中劑量組無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與失眠組比較，GBP低劑量組、中劑量組和高劑量組均升高，差異有統計學意義（P均＜0.01）（圖4）。

圖2 藥物對斑馬魚失眠癥的改善作用（與失眠組相比，aP＜0.05，bP＜0.01，各組n=10）

3 討論

圖3 各組GABRA1 mRNA的相對表達量（與正常對照組比較，aP＜0.05，與失眠組比較，bP＜0.01）

圖4 各組MTNR1 mRNA的相對表達量（與正常對照組比較，aP＜0.05，與失眠組比較，bP＜0.01）

抑郁癥主要表現為情緒低落和興趣減退，大部分患者存在睡眠問題，包括失眠及嗜睡[25]。一項流行病學調查表明，處于抑郁發作期的患者中存在失眠問題的占59.1%，而沒有睡眠問題的只有7.2%；在診斷為抑郁障礙并且無其他精神障礙的患者中，存在失眠問題的占到了58.8%，而沒有睡眠問題只有8%[26]。由此可見，抑郁癥患者中睡眠障礙的發生率高，且以失眠為主要表現形式。本實驗采用咖啡因誘導斑馬魚造成失眠模型，以LiCl（臨床作為心境穩定劑使用[27]）為陽性對照藥，給予GBP和Ginaton治療，從行為學角度，GBP和Ginaton均能通過減少失眠時間來改善斑馬魚的睡眠質量。GBP和Ginaton均為銀杏葉提取物，其主要有效成分為黃酮醇苷類和萜內酯類，有研究表明Ginaton中的二萜內酯（一類萜內酯）具有抗抑郁作用[28]，白果內酯（一種倍半萜內酯）也可能對抑郁樣行為和認知障礙有作用，這種保護作用可能是通過下丘腦-垂體-腎上腺軸達到的[29]，推測GBP的萜內酯成分同樣具有抗抑郁作用。

γ-氨基丁酸（GABA）是中樞神經系統中最重要的抑制性神經遞質，其在阻斷興奮性的傳導過程中起決定性作用[30]。GABA受體根據結構和藥理作用不同，分為離子型受體（GABAA、GABAC）和代謝型受體（GABAB），其中GABAA受體是最重要的一種[31]。GABAA為很多臨床神經活性藥物的作用靶點，其受體功能障礙與失眠、抑郁、焦慮、癲癇等密切相關[21]。目前所識別出的GABAA受體亞基種類有8個亞基族的23種單體（α1-6、β1-6、γ1-4、δ、ε、ρ1-3、θ、π）[32]，其中α亞基對其藥理作用至關重要，鎮靜效應是由GABAA受體α1亞單位介導的；α2、α3亞單位可能與抗焦慮、抗驚厥、肌松作用有關；而含α5受體的選擇性反激活劑可能為癡呆癥的治療提供有效途徑[22,33-35]。本實驗中，檢測了GBP對GABAA受體α1亞單位（GABRA1）表達的影響，結果顯示GBP能顯著降低其mRNA的表達，故推測GBP可能通過下調GABRA1的表達對失眠斑馬魚起到鎮靜作用，改善睡眠質量。

褪黑素（MTN）是由松果體分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，參與調節睡眠覺醒節律。MTN與特異性的受體結合后進入細胞內，啟動細胞信號轉導，影響神經營養因子的表達，進而調節睡眠障礙、生物節律紊亂和抑郁情緒[36]。5-羥色胺（5-HT）是MTN的前體，抑郁癥患者腦內5-HT含量的降低可以致MTN合成減少[20]。2009年2月，阿戈美拉?。ㄒ环N褪黑素受體激動劑以及5-HT2C受體的拮抗劑）獲得歐盟上市許可，用于抑郁癥成人患者的治療。有臨床研究證實阿戈美拉汀能增加海馬部位神經元的可塑性及神經元再生，具有明顯的抗抑郁作用，且起效較快，對抑郁以及伴隨的焦慮癥狀均有較好的療效[37]。哺乳動物中普遍存在褪黑素受體（MTNR）的兩類亞型，分別為MTNR1和MTNR2[38]。有研究表明，MTNR1與治療失眠和睡眠紊亂密切相關[39,40]。在本次斑馬魚失眠模型研究中，檢測了GBP對MTNR1 mRNA水平的影響，結果顯示GBP能顯著提高其表達，故推測GBP可以通過上調MTNR1 mRNA表達對失眠斑馬魚起到改善睡眠的作用。

綜上所述，本實驗采用咖啡因誘導斑馬魚造成失眠模型，給予GBP和Ginaton治療，從行為學角度證實了GBP確實對失眠癥斑馬魚的睡眠具有改善作用；GBP對GABRA1和MTNR1 mRNA水平的影響進一步來探討其抗抑郁、改善睡眠的生物靶點及其作用機制，但仍需進一步研究以發掘其深層機制。

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Influence of drug treatment on sleep in zebra fishes with insomnia and relevant mechanism

HE Dong-fang*, ZHANG Li-jun, LIU Mei-yan.*Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100029, China.

LIU Mei-yan, E-mail: china_lmy@hotmail.com

Objective To observe the relief effect of drug treatment on sleep in zebra fishes with insomnia, and discuss the influence of Ginkgo Biloba Pills (GBP) on mRNA expressions of γ-aminobutyric acid type A receptor-1 (GABRA1) and melatonin receptor-1 (MTNR1). Methods The insomnia model was established by caffeine in living zebra fishes, and zebra fishes were respectively given GBP (56 μg/mL, GBP low-dose group; 167 μg/mL, GBP mid-dose group; 500 μg/mL, GBP high-dose group), Ginaton (56 μg/mL, Ginaton low-dose group; 167 μg/mL, Ginaton mid-dose group; 500 μg/mL, Ginaton high-dose group), and lithium chloride (500 μM, positive control group), and at the same time normal control group and insomnia group was set up. The duration of zebra fishes being insomnia condition was quantified by using behavior analyzer, and relief effect of GBP on zebra fishes’ sleep was reviewed. In addition zebra fishes with insomnia were selected and given GBP [56 μg/mL (GBP low-dose subgroup), 167 μg/mL (GBP mid-dose subgroup) and 500 μg/mL (GBP high-dose subgroup)], and at the same time normal control subgroup and insomnia subgroup was set up for detecting the relative mRNA expressions of GABRA1和MTNR1 by using RT-PCR. Results The insomnia duration was longer in insomnia group than that in normal control group [(1598 ±277) s vs. (1240 ±129) s, P＜0.01] within observation time for 1 h (3600 s). The insomnia duration was shorter in positive control group (1368±170) s than that in insomnia group (P＜0.05). The meliorating effect of GBP on sleep reached, respectively, by 72% in GBP low-dose group, by 95% in GBP mid-dose group and by 97% in GBP high-dose group. The meliorating effect of Ginaton on sleep reached, respectively, by 78% in Ginaton low-dose group, by 80% in Ginaton mid-dose group and by 95% in Ginaton highdose group. The relative expression of GABRA1 mRNA decreased in GBP low-dose subgroup compared with normal control subgroup (P＜0.01), had no significant changes in insomnia subgroup, GBP mid-dose subgroup and GBP high-dose subgroup (all P＞0.05), and decreased in GBP low-dose subgroup compared with insomnia subgroup(P＜0.01). The relative expression of MTNR1 mRNA decreased in insomnia subgroup, GBP low-dose subgroup and GBP high-dose subgroup compared with normal control subgroup (all P＞0.01), had no significant changes in GBP mid-dose subgroup (P＞0.05), and increased in GBP low-dose subgroup, GBP mid-dose subgroup and GBP highdose subgroup compared with insomnia subgroup (all P＜0.01). Conclusion Low-dose, mid-dose and high-dose GBP and Ginaton all have significant meliorating effect on sleep in zebra fishes with insomnia, and the possible mechanism may be the inhibition of GABRA1 expression and melioration of MTNR1 expression.

Zebra fishes; Insomnia; Depression; γ-Aminobutyric acid type A receptor; Melatonin receptor

R749.7

A

1674-4055(2017)03-0326-05

1100029 北京,首都醫科大學附屬北京安貞醫院心臟中心

劉梅顏,E-mail:china_lmy@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.20