纖維蛋白溶解系統和轉化生長因子—1在子宮全切除術后腹腔粘連發病機制中的作用

趙小迎++金緯緯

[摘要] 目的 檢測組織纖溶酶原激活物（t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制物（PAI-1）和轉化生長因子-β（TGF-β）在術后腹腔粘連中的表達，分析其在子宮全切除術后腹腔粘連發生發展過程中的作用，探討腹腔粘連發生機制。 方法 選擇本院子宮肌瘤患者60例，均行子宮全切除術，開腹手術30例（開腹組），腹腔鏡手術30例（腹腔鏡A組），收集同期行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術病例30例（腹腔鏡B組）。開腹組腹膜打開后、術中間隔30 min、關腹前，腹腔鏡組在氣腹形成后、術中間隔30 min、結束氣腹前分別取外周血5 mL和腹膜；并于術后1 d、2 d、3 d 抽取外周靜脈血5 mL，檢測血液 t-PA、PAI-1濃度，組織 TGF-β 蛋白和 TGF-β基因表達。 結果 開腹組術中、關腹前血清 t-PA 為（27.79±1.76）ng/L和（24.68±1.73）ng/L，低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術中、關腹前血清 PAI-1為（22.46±1.22）μg/L和（24.31±1.80）μg/L，高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。開腹組關腹前組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因分別為（2.59±0.63）和（34.74±1.92），均高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統計學意義（P<0.05）；開腹組術后1 d、2 d、3 d 血清 t-PA 低于腹腔鏡A組和B組患者，PAI-1 高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 開腹組患者 PAI-1、TGF-β 蛋白和基因表達呈現較強表達，PAI-1 隨著手術時間的延長而增加，t-PA 濃度顯著降低，隨著手術時間的延長而下降。

[關鍵詞] 腹腔粘連；腹腔鏡術；組織纖溶酶原激活物；纖溶酶原激活劑抑制物等；轉化生長因子-β

[中圖分類號] R713.4+2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）09-0001-04

The role of fibrinolytic system and transforming growth factor-1 in the pathogenesis of peritoneal adhesions after total hysterectomy

ZHAO Xiaoying JIN Weiwei

Department of Obstetrics and Gynecology，Wenzhou Traditional Chinese and Western Medicine Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue plasminogen activator（t-PA）， plasminogen activator inhibitor（PAI-1）and transforming growth factor-β（TGF-β） in postoperative peritoneal adhesions， and to analyze their role in the development of abdominal adhesions after total hysterectomy，and to explore mechanism of abdominal adhesions. Methods 60 patients with uterine leiomyoma were enrolled in this study. All patients underwent total hysterectomy. There were 30 patients undergoing laparotomy（laparotomy group） and 30 patients undergoing laparoscopic surgery （laparoscopic group A）.30 cases of laparoscopic ovarian cystectomy in the same period were collected （laparoscopic group B）. 5 mL peripheral blood and peritoneum were taken after the opening of peritoneum，intraoperative interval of 30 minutes and before the closing of abdomen in the laparotomy group and after the formation of pneumo-peritoneum， intraoperative interval of 30 minutes and before the end of pneumoperitoneum in the laparoscopic group. The expression levels of blood t-PA， PAI-1 concentration， and TGF-β protein and TGF-β gene in tissue were detected by immunohistochemistry at first day， second day and third day after operation. Results The levels of serum t-PA during surgery and before the closing of abdomen were（27.79±1.76）ng/L and（24.68±1.73）ng/L in laparotomy group， which were lower than those of laparoscopic group A and group B. And the levels of serum PAI-1 during surgery and before the closing of abdomen were（22.46±1.22）μg/L and（24.31±1.80）μg/L ，which were higher than those of laparoscopic group A and group B. And the differences were significant（P<0.05）. The levels of tissue TGF-β protein and TGF-β gene were （2.59±0.63） and （34.74±1.92） in the laparotomy group， which were significantly higher than those in the laparoscopic group A and group B， and the differences were significant（P<0.05）. The serum t-PA level in laparotomy group was lower than that in the laparoscopic group A and group B at first day， second day and third day after operation. And the level of PAI-1 in laparotomy group was higher than that in laparoscopic group A and group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion PAI-1， TGF-β protein and gene in the laparotomy group were strongly expressed in the laparotomy group. t-PA concentration decreased significantly， and decreased with the operation time.

[Key words] Peritoneal adhesions；Laparoscopy；Tissue plasminogen activator；Plasminogen activator inhibitors；Transforming growth factor-β

腹腔術后出現腹腔粘連是長期困繞外科手術的一個難題，腹膜對手術的反應取決于手術創傷的程度，形成機制復雜[1]。有研究[2-3]認為血漿纖維蛋白溶解系統的活性對于腹腔粘連的溶解具有重要作用，多種細胞的遷移和增生及各種生長因子和細胞因子的了腹腔粘連過程，如組織纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纖溶酶原激活劑抑制物（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等。組織中轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是啟動和終止組織修復的一種肽類生長因子[4-5]。本研究旨在檢測t-PA、PAI-1和 TGF-β 在術后腹腔粘連中的表達水平，分析其在腹腔粘連發生發展過程中的作用，探討腹腔粘連發生機制?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2014年1月～2015年12月子宮肌瘤患者60例，均行子宮全切除術，開腹手術30例（開腹組），腹腔鏡手術30例（腹腔鏡A組）收集在本院因“良性卵巢囊腫”行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術的病例30例（腹腔鏡B組）。開腹組患者年齡36～62歲，平均（44.19±8.24）歲，腹腔鏡A組患者年齡35～61歲，平均（44.08±8.31）歲；腹腔鏡B組患者年齡37～62歲，平均（44.29±8.54）歲，各組入選研究對象年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

開腹組腹膜打開后、術中間隔30 min、關腹前分別取腹膜約 0.5 cm×0.5 cm，并抽取外周靜脈血 5 mL，腹腔鏡A組和B組在氣腹形成后、術中間隔30 min、結束氣腹前取空腹外周靜脈血 5 mL 和腹膜約 0.5 cm×0.5 cm；手術結束后1 d、2 d、3 d 抽取清晨空腹外周血 5 mL。血液樣本-20℃保存備用，組織樣本-80℃保存備用。ELISA法測定血液標本 t-PA、PAI-1 濃度。免疫組化法和 real-time PCR 檢測組織標本中 TGF-β 蛋白和 TGF-β 基因表達。

免疫組化法主要步驟：10% 福爾馬林組織固定、石蠟包埋、切片，脫蠟、梯度酒精水化；抗原修復，滴加 3% H2O2。滴加非免疫血清阻斷非特異反應；滴加 TGF-β 一抗（工作濃度1∶50）；滴加二抗和底物顯色液，蘇木素復染；二甲苯、封片。兔抗人 TGF-β 多克隆抗體免疫組化試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）。光鏡下觀察，每張片子取 5個高倍視野，每個視野下計數 100 個瘤細胞，半定量積分法對每張切片細胞進行染色強度分級記分，無著色（0分）、淡黃色（1分）和棕褐色（2分），按陽性細胞面積計0（0分）、1%～25%（1分），26%～50%（2分）、51%～75%（3分）、76%～100%（4分），將兩項乘積進行評估其陽性表達強度評估。

RT-qPCR步驟：反轉錄（依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA）、擴增（用PCR的方法擴增cDNA）、檢測（檢測和定量擴增的產物）。對硝酸纖維素膜進行掃描并進行灰度分析。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 19.0 對數據進行統計學處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，多組間計量資料采用F檢驗，計數資料比較用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組開腹前血清t-PA、PAI-1和組織 TGF-β蛋白、TGF-β基因結果比較

三組術前各項結果比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.2 三組術中血清 t-PA、PAI-1和組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因結果比較

開腹組術中血清 t-PA 為低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術中血清 PAI-1 高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 三組關腹前血清t-PA、PAI-1和組織TGF-β蛋白、TGF-β基因結果比較

開腹組關腹前血清t-PA低于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組關腹前血清PAI-1和組織TGF-β蛋白、TGF-β基因均高于腹腔鏡A組和B組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4三組術后不同時間血清t-PA和PAI-1結果比較

開腹組術后1 d、2 d、3 d血清t-PA低于腹腔鏡A組和B組患者，PAI-1高于腹腔鏡A組和B組患者，且隨著術后時間的延長，血清t-PA和PAI-1水平呈現下降和上升趨勢，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

腹腔疾病術后粘連發生率達 90% 以上，是剖腹術后一個重大難題。腹膜受到損傷時，大量吞噬細胞遷移并誘導成纖維細胞至創面，激活成纖維細胞產生膠原，并釋放多種生長因子與蛋白酶，破壞纖維蛋白溶解與合成平衡，使過度生成的膠原纖維無法被正常溶解與代謝，細胞外基質沉積而導致粘連的形成[6-8]。腹膜對手術的反應取決于手術創傷的程度，最小程度的侵入手術方式可減少術后腹腔粘連的嚴重程度。腹腔鏡手術具有腹膜損傷小，術后粘連發生率低等優點[9-10]。

多種細胞的遷移、增生及細胞因子參與了粘連過程，其中纖維蛋白原的釋放與溶解的失衡具有關鍵作用[11]。t-PA 是一種含527個氨基酸的單鏈糖蛋白，分子量6.8萬～7.2萬，為絲氨酸蛋白酶，通過裂解纖溶酶原肽鍵而發揮纖溶作用。PAI 是t-PA的拮抗劑，t-PA和PAI 可反映纖維蛋白沉積和降解之間的平衡，其相互作用決定了腹膜腔纖溶系統的活性。TGF-β 是多肽鏈組成的二聚體，TGF-β1是TGF-β家族中重要的促纖維化因子，是目前已知對纖維化形成和發展等關鍵細胞因子，可刺激間質細胞增殖產生 ECM，誘導體內各種組織纖維化反應[12-14]。

本次研究結果顯示，開腹組術中關腹前血清 t-PA和組織 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因表達均高于腹腔鏡A組和B組患者，開腹組術中血清 PAI-1 低于腹腔鏡A組和B組患者。提示傳統開腹手術引起術后腹腔粘連形成的可能性大，過表達的 TGF-β1 誘導成纖維細胞過度增殖與膠原合成。手術損傷腹腔，TGF-β1被激活并過量表達，激活 TGF-β1/Smad 信號通路，上調下游 PAI-1 的表達，下調腹膜內 t-PA 表達，增強成纖維細胞活性，抑制腹膜纖溶活性，促進成纖維細胞的過量增殖及毛細血管長入，促進多種膠原蛋白合成并在受損部位沉積，誘發粘連帶的形成[15-17]。纖維溶解酶作為體內纖維蛋白降解的重要參與者，其活化主要依靠 t-PA，t-PA 能激活纖溶酶原為纖溶酶，將纖維蛋白原和纖維蛋白降解，降低纖維的合成。t-PA 可被體內的 PAI-1所拮抗，受其調節[18-19]。本次研究結果顯示，術后1 d、2 d、3 d，腹膜 t-PA明顯下降、PAI-1明顯增加，引起術后粘連的可能性也增加。隨著手術時間延長，纖維蛋白原的釋放和纖維蛋白原的溶解之間的失衡加劇，增加術后粘連的可能性。腹腔鏡手術對腹膜的損傷小，術中氣腹使組織創面相互分離，降低接觸機會，術后腹膜縫線反應輕，均有效降低了腹膜粘連程度[20]。腹腔鏡中，氣腹的特定情況可能激活了形成粘連的各種機制，氣體的選擇、濕度、溫度和腹內壓可能決定了粘連的形成和血漿纖維蛋白溶解系統的活性，需要進一步進行研究。

綜上所述，開腹組患者PAI-1、TGF-β蛋白和基因表達呈現較強表達，PAI-1隨著手術時間的延長而增加，濃度顯著降低，隨著手術時間的延長而下降。腹腔鏡術通過降低腹膜在受到損傷TGF-β1和PAI-1的過表達，上調t-PA，實現防治術后腹膜粘連發生和發展。

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（收稿日期：2016-11-21）