羥考酮用于缺血后處理對家兔心肌缺血再灌注損傷的影響

高宏博，申文增，賈辛未，牛培，趙文萍，付立強，尚雪飛，彭燕，楊旭

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2河北大學；3保定市第一醫院)

羥考酮用于缺血后處理對家兔心肌缺血再灌注損傷的影響

高宏博1，申文增2，賈辛未1，牛培2，趙文萍1，付立強1，尚雪飛3，彭燕3，楊旭3

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2河北大學；3保定市第一醫院)

目的 探討羥考酮用于缺血后處理對缺血再灌注家兔心肌的保護作用，并觀察κ受體在羥考酮缺血后處理中的作用。方法 將48只雄性家兔隨機分為4組，假手術組開胸后左前降支只穿線，不結扎；缺血再灌注組開胸后左前降支結扎心肌缺血 30 min，再灌注 180 min，建立缺血再灌注模型；羥考酮后處理組于再灌注起始前5 min開始緩慢靜脈給予羥考酮0.3 mg/kg；κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組于再灌注起始前10 min給予κ受體拮抗劑3 mg/kg，余處理同羥考酮后處理組。于再灌注末測定各組血清CK-MB、cTnI水平，TTC法測定心肌梗死面積(IS)，計算心肌梗死面積百分比(IS/LVS)。留取心肌組織，免疫組化染色法檢測細胞縫隙連接蛋白43(CX43)表達。結果 與假手術組比較，缺血再灌注組、羥考酮后處理組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組血清CK-MB、cTnI水平升高，CX43表達降低(P均<0.05)。與缺血再灌注組比較，羥考酮后處理組IS/LVS降低，血清CK-MB、cTn-I水平降低，CX43表達升高(P<0.05或<0.01)。與羥考酮后處理組比較，κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組IS/LVS及血清CK-MB、cTn-I水平升高，CX43表達降低(P均<0.05)。結論 羥考酮缺血后處理能夠降低血清CK-MB、cTn-I，減少IS，具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用；其機制可能是通過激動κ受體后調節CX43表達來發揮心肌保護作用。

羥考酮；再灌注損傷；心??；缺血后處理；κ受體；縫隙連接蛋白43；兔

造成急性心肌梗死患者的心肌損傷有兩個過程，即冠狀動脈阻塞導致的心肌缺血損傷和冠狀動脈再通后的心肌再灌注損傷，兩者合稱為缺血再灌注損傷(IR)[1]。減少再灌注期間的心肌損傷對改善患者預后、提高患者生存質量具有重要意義。研究表明，缺血后處理及嗎啡、瑞芬太尼、美沙酮等阿片受體激動劑后處理可減輕實驗動物心肌缺血再灌注損傷[2～4]。羥考酮為半合成蒂巴因類衍生物，屬阿片類強效鎮痛藥，具有較強的κ受體激動作用。研究表明，羥考酮可減輕大鼠腸缺血再灌注誘發的肝損傷[5]，但其對心肌缺血再灌注損傷的影響尚無定論。細胞縫隙糖蛋白43(CX43)是心肌組織表達的主要縫隙連接蛋白，是決定冠狀動脈阻塞后心肌梗死面積(IS)大小的因素之一。2016年6～9月，我們對家兔心肌缺血再灌注損傷模型給予羥考酮后處理，觀察其對血清cTnI及CK-MB、IS、心肌組織CX43表達的影響，探討羥考酮對心肌缺血再灌注損傷的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級雄性家兔48只，2～3月齡，體質量2.2～2.8 kg，由河北大學動物實驗中心提供。實驗前禁食12 h、禁水2 h。鹽酸羥考酮注射液(BJ940，Hamol公司，英國)，κ受體拮抗劑nor-binaltorphimne(Tocris公司，英國)，CK-MB試劑盒、cTnI試劑盒、UniCel DxI 800免疫分析系統(貝克曼·庫爾特公司，美國)，一抗為小鼠抗大鼠CX43單克隆抗體(BD公司，美國)，二抗為山羊抗小鼠抗體(中杉金橋)，SP9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋)，DAB顯色劑(邁新試劑)，氯化三苯基四氮唑(TTC)，BL-420S生物機能實驗系統(成都泰盟)。

1.2 動物分組與處理 將家兔隨機分為假手術組、缺血再灌注組、缺血后處理組、羥考酮后處理組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組各12只。參照文獻[6]方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。向家兔耳緣靜脈注射25%氨基甲酸乙酯麻醉后，仰臥位固定。于左側胸壁第3、4肋間距離胸骨左緣約0.5 cm處逐層鈍性分離開胸，剪開心包膜，暴露心臟。在左心耳下方1～2 mm處，以5-0無損傷縫合線在左冠狀動脈前降支下穿線，進針深度約1.5 mm。將縫線兩端穿過內徑0.1 cm、長2 cm的硅膠管，穩定10 min后束緊結扎線，行左冠狀動脈缺血30 min，然后松開結扎線進行再灌注180 min。缺血成功的標準：結扎線以下心肌組織發紺，ECG示胸導聯ST段抬高>0.3 mV；再灌注成功的標準：心肌局部反應性充血，ECG示胸導聯抬高的ST段下降1/2以上。假手術組僅穿線不結扎；缺血再灌注組左前降支結扎心肌缺血30 min，再灌注180 min；羥考酮后處理組于再灌注起始前5 min開始緩慢靜脈給予羥考酮0.3 mg/kg；κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組于再灌注起始前10 min給予κ受體拮抗劑3 mg/kg，余處理同羥考酮后處理組。

1.3 血清cTnI、CK-MB水平檢測 于再灌注3 h時，用EDTA抗凝管經頸靜脈采集血樣2～3 mL，離心取上清。采用UniCel DxI 800免疫分析系統、磁粒子化學發光法檢測血清cTnI、CK-MB水平。

1.4 IS測定 采集頸靜脈血后處死家兔，快速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗。將左心室-20 ℃冷凍15 min取出，自心尖向心底部垂直心室長軸方向切2 mm厚切片5～6片，加入含1% TTC的PBS溶液中溫育15 min，中性甲醛固定。用數碼相機自心底向心尖方向照相，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算白色梗死區的總面積，即IS。以IS占總面積的百分比計算心肌梗死面積百分比(IS/LVS)，重復測量3次取平均值。

1.5 心肌組織CX43表達檢測 采用免疫組化方法。在家兔心臟左冠狀動脈前降支下穿線處下方，橫向切取厚約0.2 cm的心肌切片，中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，常規脫蠟至水。將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中高壓加熱，冷卻，PBS沖洗。3% H2O2去離子水孵育10 min，PBS沖洗。滴加封閉用山羊血清，室溫孵育15 min。依次加入一抗(小鼠抗大鼠CX43單克隆抗體)、二抗(山羊抗小鼠抗體)，PBS沖洗。滴加辣根標記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取3個400×不重疊代表性視野拍照，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定平均光密度OD值，作為CX43表達量的半定量分析。

2. 結果

2.1 各組血清cTnI、CK-MB水平比較 排除實驗過程中死亡的家兔，假手術組、缺血再灌注組、羥考酮后處理組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組各剩余11、10、11、10只。各組血清cTnI、CK-MB水平比較見表1。

表1 各組血清cTnI、CK-MB水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組比較，△P<0.05；與羥考酮后處理組比較，#P<0.05。

2.2 各組IS/LVS比較 假手術組、缺血再灌注組、羥考酮后處理組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組的IS/LVS分別為0、18.28%±2.89%、12.85%±1.77%、16.13%±2.60%。與假手術組比較，其他三組IS/LVS均升高(P均<0.05)；羥考酮后處理組較缺血再灌注組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組明顯減少(P均<0.05)，缺血再灌注組與κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.3 各組心肌組織CX43表達比較 假手術組可見CX43棕黃色陽性信號密集，表達分布規律，呈條索狀和簇狀；缺血再灌注組陽性信號呈弱的彌散或點狀樣改變，表達不清晰、無規則；羥考酮后處理組陽性信號分布相對均一，接近假手術組；κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組陽性信號不清晰、分布零亂、無規律，與缺血再灌注組相似。假手術組、缺血再灌注組、羥考酮后處理組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組CX43表達OD值分別為28.28±3.50、10.55±2.25、15.74±3.77、11.09±1.70。與假手術組比較，其他三組OD值均降低(P均<0.05)；羥考酮后處理組較缺血再灌注組、κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組升高(P均<0.05)，缺血再灌注組與κ受體拮抗劑+羥考酮后處理組比較無統計學差異(P>0.05)。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是指在短時間內心肌血供中斷，一定時間內恢復血供后，原缺血心肌發生較缺血時更為嚴重的損傷[7，8]。臨床表現為再灌注后血壓下降，PCI術中發生無再流或慢血流現象[9]，不能實現心肌細胞微循環的再灌注，胸痛癥狀反復發作，術后發生梗死后的心肌功能喪失、心室重塑、心功能不全、梗死后心衰及惡性心律失常，近期及遠期死亡率增加，嚴重影響急性心肌梗死患者的預后。

缺血后處理是通過再灌注起始給予3次30 s缺血/30 s再灌注干預，來減輕再灌注損傷，減少心肌梗死面積。研究表明，再灌注期間給予他汀類藥物、鉀離子通道開放劑類藥物、M膽堿受體阻滯劑藥物、阿片肽類鎮痛藥等可對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用，即藥物后處理。藥物后處理可避免缺血后處理操作上帶來的機械性損傷，擁有更好的臨床應用價值。目前許多新型阿片類受體激動劑如芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等廣泛用于圍手術期的心肌保護，阿片樣物質可以模擬心肌缺血預處理和后處理的方式減輕缺血再灌注，減少心肌梗死面積，降低心律失常的發生率，具有明確的心肌保護作用。羥考酮是一種強效阿片類受體激動劑，與嗎啡、瑞芬太尼、舒芬太尼等阿片類藥物相比，羥考酮除有強效的μ受體激動作用外，還有較強的κ受體激動作用[10]。激動κ受體可通過PI3K通路開放線粒體膜ATP依賴的鉀離子通道，抑制細胞內鈣超載與氧自由基的釋放，最終減少心肌細胞的壞死與凋亡，在阿片類藥物的心肌保護機制中占用重要的地位[11]。此外，羥考酮對內臟痛和神經病理性疼痛的抑制作用更強[12]，與嗎啡等相比，羥考酮可能更好地抑制心肌梗死患者因疼痛所帶來的應激反應，從而降低心肌氧耗。CK-MB、CTnI均為心肌細胞內的特異蛋白，當心肌壞死時釋放入血，可反映心肌受損的程度。一般認為CTnI最具特異性，CK-MB在心肌再梗死時敏感性更佳。本研究顯示，羥考酮后處理組可顯著減少心肌梗死面積、降低血清CK-MB、CTnI釋放，具有確切的減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。而加入κ受體拮抗劑后，羥考酮的上述心肌保護作用則被消除。提示羥考酮的心肌保護作用與κ受體激活有關。

縫隙連接由相鄰細胞膜上2個連接子構成，是細胞間電信號直接傳遞和胞質物質交換的結構基礎，并參與缺血再灌注心肌的保護作用。CX43是心肌組織表達的主要縫隙連接蛋白，是決定冠狀動脈阻塞后IS大小的因素之一。生理狀態下，CX43主要呈簇狀位于細胞膜閏盤處呈端端連接，少量位于側側連接或存在于線粒體內，CX43的分布和結構改變對縫隙連接的活性有重要影響。當心肌發生缺血再灌注損傷時，縫隙連接蛋白的表達、分布和功能都將發生變化[13]。本研究顯示，羥考酮后處理可改善家兔缺血再灌注心肌CX43表達，使CX43分布相對均一，接近假手術組。提示羥考酮后處理可改善CX43表達與分布。而加入κ受體拮抗劑后，CX43分布不規律，與缺血再灌注組相似。提示羥考酮的作用可能與激活心肌細胞的κ受體有關。阿片受體激動劑激動κ受體可抑制CX43重構，穩定CX43的合成與降解，從而發揮抗缺血再灌注損傷的作用[14]。

綜上所述，羥考酮后處理可減輕家兔心肌缺血再灌注損傷，其保護作用可能由κ受體介導，通過改善心肌組織CX43表達，減少心肌梗死面積。

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賈辛未(E-mail: jxw1967@126.com)

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