探討鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞增殖、凋亡與自噬的作用

鄭穎 王剛陽 陳瑞玲 華瑩奇 蔡鄭東

. 臨床研究與實踐 Clinical research and practice .

探討鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞增殖、凋亡與自噬的作用

鄭穎 王剛陽 陳瑞玲 華瑩奇 蔡鄭東

目的探討鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞 ( 143B HOS ) 增殖，骨肉瘤細胞凋亡與自噬的作用。方法用 CCK8 實驗觀察鴉膽子素 D 對 143B HOS 增殖的影響；用平板克隆實驗觀察鴉膽子素 D 對 143B HOS細胞集落形成的影響；用流式細胞儀檢測鴉膽子素 D 對 143B HOS 周期阻滯以及誘導凋亡的作用情況；用Western Blot 檢測 143B HOS 基礎凋亡與自噬以及經鴉膽子素 D 誘導之后的凋亡與自噬情況；用熒光顯微鏡檢測 143B 細胞基礎 LC3 熒光鼬合蛋白表達以及經鴉膽子素 D 誘導之后的 LC3 熒光鼬合蛋白表達情況。結果( 1 ) CCK8 實驗顯示鴉膽子素 D 作用后 143B HOS 細胞的存活率下降，同時，也減少了 143B HOS 細胞克隆數的形成；( 2 ) 流式細胞儀檢測細胞周期顯示鴉膽子素 D 使 143B HOS 的 G0 / G1 期細胞比例增高；( 3 ) 流式細胞儀檢測細胞凋亡實驗顯示，鴉膽子素 D 使 143B HOS 的細胞凋亡比例增加；Western Blot 檢測 143B HOS 細胞Cleaved PARP 的表達，結果顯示，鴉膽子素 D 誘導 Cleaved PARP 表達增加；( 4 ) Western Blot 檢測 143B HOS細胞 LC3B 的表達，結果顯示，鴉膽子素 D 誘導 LC3B-II 的表達增加；熒光顯微鏡檢測 143B 細胞的 LC3 熒光鼬合蛋白實驗，結果顯示，鴉膽子素 D 誘導 143B 細胞綠色熒光斑點生成增多。結論( 1 ) 鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細胞增殖；( 2 ) 鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞的凋亡；( 3 ) 鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞自噬。

骨肉瘤；鴉膽子素；細胞增殖；細胞凋亡；自噬

骨肉瘤是臨床最常見的原發性惡性骨腫瘤，以10～20 歲青少年發病居多。據統計，每年每 100 萬0～20 歲的人群中就有約 4～5 人發病[1]。好發部位為股骨遠端、脛骨近端以及肱骨近端的干骺端。約80% 患者死于腫瘤的遠處轉移，其中多為肺轉移。針對轉移患者治療方法有限，已發生轉移患者的生存率在近幾十年里并沒有顯著提高[2]。研究表明：新輔助化療下的外科手術治療是目前骨肉瘤的主要治療方法[3]。手術前化療效果 ( 使用 Huvos 分級進行評分 )，是骨肉瘤患者預后好壞的關鍵因素[4]。在最近 20 年里，隨著新型化療藥物的應用，使得骨肉瘤的 5 年生存率從不足 20% 提高至 65%～75%。盡管臨床中已取得較大進步，現今仍有超過 30%～40%的患者即便是在采用高強度化療后仍得不到有效治療[5]。因此，開發出更為有效，毒副作用相對低的化療藥物不失為提高患者生存率的可行之策。

鴉膽子是一種中藥植物，鴉膽子素 D ( Bruceine D ) 是從鴉膽子中分離提取出來的一種化合物。研究表明，鴉膽子素 D 對肝癌細胞[6]、胰腺癌細胞[7]等均有不同程度的抑制作用。但其對骨肉瘤細胞的抑制作用尚未見報道。為了研究鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞的作用，筆者選取了 143B HOS 兩個細胞系作為研究對象，使用 CCK8 實驗與平板克隆實 驗研究不同物質量濃度下，鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞增殖的作用效果。同時，使用流式細胞儀來檢測不同物質量濃度下的鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞的周期及誘導凋亡的作用；使用蛋白質印跡實驗對凋亡相關蛋白、自噬相關蛋白表達檢測，探討鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞的作用。

材料與方法

一、實驗設計

細胞分子生物學體外實驗。

本實驗于 2016 年 6～12 月在上海交通大學附屬第一人民醫院上海市骨腫瘤研究所完成。

二、實驗材料

人骨肉瘤細胞株 143B HOS 購自美國菌種保藏中心 ( ATCC )。鴉膽子素 D ( 分析標準品；純度HPLC＞98%，貨號 B21415 -20 mg，購自上海源葉生物科技有限公司 ) 將其溶于二甲基亞砜中，配置成 20 mmol / L 的工作母液，置于 -20 ℃ 的冰箱中備用，使用前用 DMEM 血清培養液調至所需濃度。DMEM 高糖培養基，胎牛血清 ( 美國 Thermo 公司 )；Cleaved PARP 抗體，LC3B 抗體，GAPDH 抗體，辣根過氧化物酶標記二抗 ( 斯信生物科技有限公司 )；二甲基亞砜 ( 美國 Sigma 公司 )；0.02% EDTA＋0.25% 胰蛋白酶 ( 德國 Miltenyi Biotec 公司 )；恒溫培養箱 ( 上海茸研儀器公司 )；流式細胞儀 ( 美國 Becton Dickinson 公司 )；多功能酶標儀 ( 美國 Molecular Devices 公司 )；DMI3000B 熒光顯微鏡( 德國 Leica 公司 )。

三、實驗方法

1. 細胞培養：將骨肉瘤細胞株 143B HOS 培養在 DMEM 完全培養液中 ( 含有體積分數為 10% 胎牛血清、0.1 g / L 鏈霉素、100 U / ml 青霉素 )，于37 ℃、體積分數為 5% CO2恒溫培養箱中培養。待細胞融合度達到 85% 左右時，用 0.02% EDTA＋0.25% 胰蛋白酶混合消化液進行消化，然后收集細胞 600 g 離心 3 min，傳代培養。

2. CCK8 檢測細胞增殖情況：收集對數生長期的 143B HOS 細胞，PBS 清洗，計數，分管，按3000 個 / 孔細胞數加入 96 孔板中，培養 24 h 使細胞貼壁，之后加入不同物質的量濃度鴉膽子素 D ( 0，0.25，0.5，1，2，4 μM ) 進行培養 24 h，然后進行檢測。每孔加入用 DMEM 培養基稀釋 10 倍的 CCK8試劑 100 μl 于 37 ℃ 孵育 45 min。使用酶標儀檢測各孔在 450 nm 處的吸光度值。

3. 平板克隆實驗：用不同物質的量濃度的鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 對 143B HOS 細胞進行處理，作用 24 h 后吸去上層液體，用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，用 0.1% 結晶紫染色10 min，PBS 漂洗 2 次，風干后拍照。

4. 免疫印跡實驗檢測細胞凋亡與自噬相關蛋白：分別提取用含 0，1，2，4 μM 不同濃度鴉膽子素 D 培養液培養 24 h 的 143B HOS 細胞中的總蛋白，檢測凋亡蛋白 Cleaved PARP 和自噬蛋白 LC3B的表達，進行定量，然后使用 10% 的分離膠進行電泳。在冰浴下 100 V 轉膜 1 h。使用 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，加入相對應的一抗 ( Cleaved PARP 抗體，LC3B 抗體和內參蛋白 GAPDH 抗體 ) 4 ℃ 孵育過夜，采用 TBST 進行洗滌 3 次，每次 10 min。之后加入二抗，37 ℃ 孵育 1 h，使用 TBST 洗滌 3 次，每次 15 min，在暗室中壓片，然后進行顯影、定影。

5. 流式細胞儀檢測細胞周期：將 143B HOS 細胞加入到含有不同物質的量濃度鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 的培養液中進行培養，24 h 后收集細胞，600 g 離心 1 min PBS 清洗。用 70% 乙醇固定，加入周期試劑盒 PI 染液，室溫避光孵育 15 min，用流式細胞儀進行檢測。圖像使用 ModFit 軟件進行分析。重復實驗 3 次。

6. 流式細胞儀檢測細胞凋亡：將 143B HOS 細胞加入到含有不同物質的量濃度鴉膽子素 D ( 0，1，2，4 μM ) 的培養液中進行培養，24 h 后收集細胞，600 g 離心 1 min，PBS 清洗。然后使用 Annexin-VFITC / PI 細胞凋亡檢測試劑盒檢測其凋亡情況，將細胞加入到 100 μl 1×Binding 緩沖液中重懸，添加 5 μl Annexin V-FITC 和 2.5 μl PI 染料，進行避光振蕩混勻，室溫反應 15 min，然后再加入 300 μl 1×Binding 緩沖液，混勻，行流式細胞儀檢測。重復試驗 3 次。

7. LC3 熒光鼬合蛋白檢測實驗：將 GFP-LC3 質粒瞬時轉染至 143B 細胞內，隨后使用不含鴉膽子素D 和含有 2 μM 鴉膽子素 D 的培養基對轉染成功后的143B 細胞作用 24 h。之后使用 PBS 清洗 2 次，使用4% 多聚甲醛固定 20 min，使用 0.1% Triton X-100 通透化處理，用 DAPI 作用 15 min，最后用熒光顯微鏡進行觀察。

四、觀察指標

不同物質的量濃度鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞增殖、凋亡以及自噬的影響。

五、統計學處理

采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料用 x-±s 表示，采用 t 檢驗，兩兩比較組間差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細胞增殖

含有 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μM 6 種不同濃度鴉膽子素 D 的培養液培養骨肉瘤細胞 24 h 與48 h，不同作用濃度及作用時間下 143B HOS 細胞增值率結果如表 1 所示。相同作用時間內隨著鴉膽子素 D 物質的量濃度的升高，細胞的增殖率下降，與對照組 ( 0 μM ) 相比差異有統計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 1a )。此外，隨著藥物濃度的增加，細胞的克隆形成數逐漸減少 ( 圖 1b )。

二、鴉膽子素 D 引起骨肉瘤細胞周期阻滯

用含 0、1.0、2.0、4.0 μM 鴉膽子素 D 的培養液培養細胞 24 h，流式細胞儀檢測其各周期相占比。實驗結果如表 2 所示?？梢?，隨著作用濃度的升高，處于 G0 / G1 期的細胞比例逐漸升高，處于G2 / M 期的細胞比例逐漸下降，與對照組 ( 0 μM ) 相比差異有統計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 2 )。

三、鴉膽子素 D 促進骨肉瘤細胞凋亡

用含 0、1.0、2.0、4.0 μM 鴉膽子素 D 的培養液培養細胞 24 h，流式細胞儀檢測其凋亡率。實驗結果如表 3 所示。隨著鴉膽子素 D 質量濃度的升高，細胞的凋亡率增加 ( 圖 3 )。不同物質的量濃度鴉膽子素 D 處理的細胞與對照組 ( 0 μM ) 相比在凋亡率上差異均有統計學意義。

此外，采用蛋白質印跡實驗檢測了在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 培養液處理下細胞凋亡相關蛋白 Cleaved PARP 的表達水平。加有鴉膽子素 D 組細胞中 Cleaved PARP 蛋白的表達水平高于未加藥組，且隨著藥物濃度的升高，Cleaved PARP蛋白的表達也隨之上升 ( 圖 4 )。

表 1 鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞增殖的影響 ( x- ± s，% )Tab.1 Effects of Bruceine D on the proliferation of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

表 2 鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞周期的影響 ( x- ± s，% )Tab.2 Effects of Bruceine D on the cell cycle of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

圖 1 鴉膽子素 D 抑制骨肉瘤細胞增殖 a～b：CCK8 實驗檢測鴉膽子素 D 對 143B HOS 細胞增殖的影響；c～d：平板克隆實驗檢測鴉膽子素 D 對 143B HOS 細胞克隆形成的影響 ( 與對照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )Fig.1 Bruceine D inhibited the proliferation of osteos arcoma cells a - b: The anti-proliferative effects of Bruceine D on 143B HOS cells were detected by CCK8 assay; c - d: The results of colony formation assay showed the effects of Bruceine D on the colony formation of colonies of 143B HOS cells (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group )

圖 2 鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞 G0 / G1 期阻滯a：鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞周期阻滯結果；b：直方圖 ( 與對照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )Fig.2 Bruceine D induced G0 / G1 phase arrest in osteosarcoma cells a: The results of cell cycle arrest assay; b: Histogram (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group )

圖 3 鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞凋亡 a：鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞凋亡的流式細胞儀分析結果；b：直方圖 ( 與對照組 0 μM 相比，*P ＜ 0.05 )；c：Western Blot 檢測不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS 細胞 Cleaved PARP 的表達情況Fig.3 Evidence that Bruceine D induced apoptosis in osteosarcoma cells a: The apoptosis proportion of 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D was analyzed by fl ow cytometry; b: Histogram (*P ＜ 0.05, when compared to 0 μM in the control group ); c: The expression of Cleaved PARP in 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D was detected by western blot assay

表 3 鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞凋亡的影響 ( x- ± s，% )Tab.3 Effects of Bruceine D on the apoptosis of osteosarcoma cells ( x- ± s, % )

四、鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞發生自噬

用 0、1.0、2.0、4.0 μM 4 種不同濃度鴉膽子素 D 培養液處理 143B HOS 細胞 24 h，采用蛋白質印跡實驗檢測了不同藥物濃度下細胞自噬相關蛋白LC3B 的表達情況 ( 圖 4b )，隨著藥物濃度的增加，LC3B-I 蛋白的表達量逐漸減少，LC3B-II 蛋白的表達量逐漸增加。之后，采用 LC3 熒光鼬合蛋白檢測實驗來檢測自噬體的存在。與對照組相比，經過鴉膽子素 D 培養液處理的 143B 細胞的綠色熒光斑點明顯增多 ( 圖 4a )。

討 論

CCK8 實驗可以用于檢測藥物對細胞的增殖抑制情況。實驗結果顯示，隨著藥物濃度的升高，細胞的存活率逐漸下降，說明鴉膽子素 D 具有抑制骨肉瘤細胞增殖的作用。平板克隆實驗可用于研究藥物對細胞的毒性以及細胞對藥物的敏感性[8]，也可以反映細胞增殖特點以及群體依賴性，結果顯示，隨著藥物濃度的提高，細胞克隆數也隨之減少，這也進一步證實了鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞的增殖抑制作用。

細胞分裂的周期大致分為四個時相：G1 期、S 期、G2 期以及 M 期。一些細胞周期特異性藥物只對增殖周期的某一時相敏感，可通過將細胞阻滯于某一周期進而抑制細胞的增殖。為了探究鴉膽子素 D 是否具有這一特征，筆者進行了細胞周期檢測。流式細胞儀檢測顯示，在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 作用下，處于 G0 / G1期的 143B HOS 細胞比例隨著藥物濃度的增加而增加，各濃度與對照組 ( 0 μM ) 相比差異有統計學意義 ( P＜0.05 )。這表明鴉膽子素 D 具有阻滯 G0 / G1期細胞，延長細胞增殖周期作用。而這也一定程度上解釋了鴉膽子素 D 為什么會抑制骨肉瘤細胞的增殖。

目前認為細胞程序性死亡主要有三種方式：凋亡[9]、壞死及細胞自噬導致的自噬性細胞死亡[10]。為了探究誘發細胞凋亡是否為鴉膽子素 D 抑制細胞增殖的原因，筆者使用流式細胞儀檢測在 0、1.0、2.0、4.0 μM 不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS細胞的凋亡情況。結果顯示，對照組 ( 0 μM ) 細胞中凋亡細胞比例很少，隨著藥物濃度增加，凋亡細胞比例明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義 ( P＜0.05 )。為了進一步確證鴉膽子素 D 對骨肉瘤細胞的凋亡促進作用，筆者又檢測了藥物作用下143B HOS 細胞中 Cleaved PARP 的蛋白表達情況。PARP ( 聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶 ) 可識別結構損傷的 DNA 片段，有助于修復蛋白與 DNA 結合并進行修復[11]。當細胞發生凋亡時，其被 caspase-3 裂解形成 Cleaved PARP 從而失去活性[12]，故可作為細胞發生凋亡的標志蛋白之一。在蛋白質印跡試驗中，對照組的 Cleaved PARP 蛋白幾乎不表達，而隨著藥物濃度的增加，c-PARP 的表達也逐漸增高這進一步說明了鴉膽子素 D 可以誘導骨肉瘤細胞的凋亡。

圖 4 鴉膽子素 D 誘導骨肉瘤細胞自噬 a：不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B 細胞內 GFP-LC3 熒光斑點的熒光顯微鏡分析，比例尺為50 μM；b：Western Blot 檢測不同濃度鴉膽子素 D 作用下 143B HOS 細胞 LC3B-I 與 LC3B-II 的表達情況Fig.4 Evidence that Bruceine D induced autophagy in osteosarcoma cells a: The punctate patterns of GFP-LC3 expression in 143B cells treated with various concentrations of Bruceine D were examined using fl uorescent microscope. Scale bars = 50 μM; b: The expressions of LC3B-I and LC3B-II in 143B HOS cells treated with various concentrations of Bruceine D were detected by western blot assay

為進一步探究鴉膽子素 D 是否可以誘導骨肉瘤細胞的自噬，筆者對不同藥物濃度處理后的143B HOS 細胞 LC3B 蛋白的表達進行了蛋白質印跡檢測。LC3B 為 LC3 蛋白的一種，LC-3 為目前檢測最為廣泛的自噬相關蛋白之一，從 LC3B-I 到LC3B-II 的轉變以及 LC3B-II 的積聚可以從一定程度上反應細胞自噬的發生[13]。實驗結果顯示，隨著藥物濃度的增加，LC3B-II 的表達也隨之升高。LC3 熒光鼬合蛋白檢測實驗也是常見的檢測細胞自噬的方法之一，與對照組 ( 0 μM ) 相比，經 2 μM 鴉膽子素D 處理后的 143B 細胞的綠色熒光斑點顯著增多，提示鴉膽子素 D 使得 143B 細胞的自噬體生成增多，這說明鴉膽子素 D 可以誘導骨肉瘤細胞自噬的發生。

綜上所述，鴉膽子素 D 具有抑制骨肉瘤 細胞增殖，誘導骨肉瘤細胞凋亡和自噬作用。這意味著鴉膽子素 D 在骨肉瘤治療方面可能存在著潛在的價值，但對骨肉瘤細胞作用的具體機制并不明了，還需更多后續研究。

[1] Zheng Y, Cheng Y, Chen J, et al. Injectable hydrogelmicrosphere construct with sequential degradation for locally synergistic chemotherapy[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(4):3487-3496.

[2] Flores RJ, Kelly AJ, Li Y, et al. A novel prognostic model for osteosarcoma using circulating CXCL10 and FLT3LG[J]. Cancer, 2017, 123(1):144-154.

[3] Serra M, Hattinger CM. The pharmacogenomics of osteosarcoma[J]. Pharmacogenomics J, 2017, 17(1):11-20.

[4] Salas S, Jiguet-Jiglaire C, Campion L, et al. Correlation between ERK1 and STAT3 expression and chemoresistance in patients with conventional osteosarcoma[J]. BMC Cancer, 2014, 14:606.

[5] Jabeen S, Holmboe L, Alnaes GI, et al. Impact of genetic variants of RFC1, DHFR and MTHFR in osteosarcoma patients treated with high-dose methotrexate[J]. Pharmacogenomics J, 2015, 15(5):385-390.

[6] Xiao Z, Ching Chow S, Han Li C, et al. Role of microRNA-95 in the anticancer activity of Brucein D in hepatocellular carcinoma[J]. Eur J Pharmacol, 2014, 728:141-150.

[7] Lau ST, Lin ZX, Leung PS. Role of reactive oxygen species in brucein D-mediated p38-mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappaB signalling pathways in human pancreatic adenocarcinoma cells[J]. Br J Cancer, 2010, 102(3):583-593.

[8] Plumb JA. Cell sensitivity assays: clonogenic assay[J]. Methods Mol Med, 2004, 88:159-164.

[9] Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J]. Br J Cancer, 1972, 26(4):239-257.

[10] Clarke PG. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms[J]. Anat Embryol (Berl), 1990, 181(3):195-213.

[11] Eustermann S, Videler H, Yang JC, et al. The DNA-binding domain of human PARP-1 interacts with DNA single-strand breaks as a monomer through its second zinc fi nger[J]. J Mol Biol, 2011, 407(1):149-170.

[12] Meguro T, Chen B, Parent AD, et al. Caspase inhibitors attenuate oxyhemoglobin-induced apoptosis in endothelial cells[J]. Stroke, 2001, 32(2):561-566.

[13] Kimura S, Fujita N, Noda T, et al. Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3[J]. Methods Enzymol, 2009, 452:1-12.

( 本文編輯：裴艷宏 )

Effects of Bruceine D on the proliferation, apoptosis and autophagy of osteosarcoma cells

ZHENG Ying, WANG Gang-yang, CHEN Rui-ling, HUA Ying-qi, CAI Zheng-dong. Department of Orthopedics, the fi rst People’s Hospital Aff i liated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai Bone Tumor Instituticn, Shanghai, 200080, China

CAI Zheng-dong, Email: czd856@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the definite effects of Bruceine D on inhibiting the proliferation of osteosarcoma cells and inducing the apoptosis and autophagy in osteosarcoma cells.MethodsThe anti-proliferative effects of Bruceine D on 143B HOS cells were detected by CCK8 assay. Colony formation assay was used to detect the colony formation of 143B HOS cells treated with Bruceine D. The Bruceine D’s effects of cell cycle arresting on 143B HOS cells were analyzed by fl ow cytometry. The Bruceine D’s effects of inducing apoptosis in 143B HOS cells were investigated by fl ow cytometry and Western blot assay. We measured the autophagy associated proteins expressed in 143B HOS cells treated with Bruceine D by fl uorescence microscope. The Bruceine D’s effects of inducing autophagy were also investigated by GFP-LC3 punctate assay.Results( 1 ) The CCK8 assay showed that the cell viability and number of colonies of 143B HOS treated with Bruceine D were decreased. ( 2 ) A higher ratio of G0 to G1 phase cells in 143B HOS was caused by Bruceine D, which was found by using fl ow cytometry. ( 3 ) The apoptosis proportion of 143B HOS treated with Bruceine D was increased, which was found by using fl ow cytometry; The western blot assay showed the expression level of Cleaved PARP was increased in 143B HOS. ( 4 ) The western blot assay showed the expression level of LC3B-II was increased in 143B HOS; The 143B cells treated by Bruceine D displayed a punctate pattern of GFP-LC3 expression, which was found by using fl uorescence microscope.Conclusions( 1 ) Bruceine D inhibits the proliferation of osteosarcoma cells. ( 2 ) Bruceine D induces the apoptosis of osteosarcoma cells. ( 3 ) Bruceine D induces the autophagy of osteosarcoma cells.

Osteosarcoma; Bruceine; Cell proliferation; Apoptosis; Autophagy

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.06.007

R738.1, R915

國家自然科學基金項目 ( 81202115 )

作者單位：200080 上海交通大學附屬第一人民醫院骨科，上海市骨腫瘤研究所

蔡鄭東，Email: czd856@vip.163.com

2017-01-20 )