番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學特性研究

喬鏡澄+劉宇+馬敬昊+王謙

摘要：從天津地區產的番茄黑斑病的疑似樣本中分離得到5株形態相近的內生真菌，對其形態學和生物學特性進行研究。結果表明，該菌為鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]，PDA為其最適宜生長的培養基；菌絲在5～37 ℃ 范圍內均能生長，最適的生長溫度和孢子萌發溫度為28 ℃，病原菌的致死溫度為65 ℃處理20 min，菌絲生長和孢子萌發的最適pH值為6，黑暗條件最適合菌絲生長，分生孢子在黑暗條件下萌發率最高；該病原菌對碳源、氮源選擇不苛刻，最適的碳源為乳糖，氮源為酵母膏。

關鍵詞：番茄；黑斑??；病原鑒定；生物學特性；致死溫度；最適生長

中圖分類號： S436.412.1+9文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0094-03

番茄黑斑病是番茄常見的病害之一，此病是由半知菌亞門番茄鏈格孢真菌[Alternaria tomato （CKe.） Weber]侵染引起的，鏈格孢菌是茄科植物中危害較大的病害之一。該病不僅發生在田間，更是采后貯藏過程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類蔬菜，主要通過氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實，在適宜的條件下產生大量孢子，對果實造成嚴重危害[1]。

研究表明，鏈格孢菌所產生的選擇性毒素對植物有致病性，對人體健康也有一定的影響[1]，所以研究鏈格孢菌的生長特性，探究鏈格孢菌在不同溫度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落長勢、直徑、菌絲生長速率、菌絲干質量、產孢量的變化，可以探明鏈格孢菌在不同條件下的生長趨勢。

1材料與方法

1.1試驗材料

PDA固體培養基：200 g馬鈴薯，20 g瓊脂，20 g葡萄糖，加水補足1 000 mL。PCA固體培養基：5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸粉，1.0 g葡萄糖，20 g瓊脂，pH值為7，加水補足 1 000 mL。胡蘿卜固體培養基：將胡蘿卜去皮后稱取200 g，20 g瓊脂，加水補足1 000 mL。番茄果肉固體培養基：200 g番茄，20 g瓊脂，加水補足1 000 mL。V8果汁固體培養基：罐裝V8果汁200 mL，20 g瓊脂，加水補足1 000 mL。查彼（Czapek）固體培養基：2 g NaNO3，1 g K2HPO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，0.01 g FeSO4，30 g蔗糖，20 g瓊脂，加水補足 1 000 mL。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離

根據方仲達的方法[2]，對番茄發病處病原菌進行分離，采用單孢子分離法獲得純化菌株，在PDA培養基上培養后保存備用。生物學特性研究以所獲得的純化菌株tomato（b）為供試菌株。

1.2.2病原菌形態學鑒定

將供試菌株在PDA培養基上活化，25 ℃恒溫培養6 d后，用無菌水制成一定濃度的孢子懸液，同時觀察菌落顏色、大小、形狀及分生孢子的形態和顏色，從而進行病原菌的鑒定。

1.3生物學特性的研究

1.3.1溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響[3]

用打孔器將菌體轉移至PDA培養基上，分別置于1、4、15、25、28、30、37、40 ℃的培養箱內，黑暗條件下培養7 d，用十字交叉法測量菌落的直徑，采用小室培養法，將孢子懸液滴于凹玻片上，置于以上條件下培養3、6、12 h后，分別檢查孢子萌發率。使用棉藍乳酚油固定孢子懸液，鏡檢200個孢子，記下萌發的孢子數量，計算萌發率。每個處理3次重復。

1.3.2pH值對菌絲生長和孢子萌發的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH調節PDA培養基的pH值和孢子懸液的pH值為3～12。分別置于28 ℃恒溫、黑暗條件下和小室恒溫培養，觀察菌落直徑，計算孢子萌發率。

1.3.3光照條件對菌絲生長和孢子萌發的影響

將接入菌塊的PDA培養基和孢子懸浮液，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3種處理條件下，于28 ℃恒溫培養。觀察菌落直徑，計算孢子萌發率。

1.3.4不同培養基對菌株生長的影響

分別以PDA、PCA、番茄果肉固體培養基、V8果汁固體培養基和胡蘿卜固體培養基用打孔器將菌體轉移至固體培養基中心位置，置于28 ℃下恒溫培養7 d，用十字交叉法測量菌落的直徑。每個樣品3次重復，計算平均值。

1.3.5不同碳源和氮源對菌絲生長和孢子萌發的影響[4]

選取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖等量替換查彼培養基中的碳源（蔗糖），使得各個不同碳源培養基中碳的含量相同；用不加碳源的培養基作為對照。

選取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培養基中的氮源（硝酸鈉），使得各個不同碳源培養基中氮的含量相同；用不加氮源的培養基作為對照。

將菌塊轉接到PDA固體平板中央，放置在28 ℃恒溫培養箱內培養，3、6 d后用十字交叉法測量菌落的直徑，對照平行組計算出平均數，每組試驗重復3次。

1.3.6光照對菌株生長和孢子萌發的影響

將菌塊轉接到PDA固體培養基內，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照（全光）和完全黑暗（無光）3種處理條件下，28 ℃恒溫培養箱內培養；3、6 d 后測量菌落的直徑，對照平行組計算出平均數，每組試驗重復3次。

將制備好的孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3種處理條件下，28 ℃的恒溫培養箱內培養，6、12 h后測定孢子萌發率。

1.3.7致死溫度的確定

吸取1 mL孢子懸液至無菌試管中，分別置于40～65 ℃（以5 ℃為梯度）的恒溫水浴鍋中處理5～20 min后迅速冷卻。將處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，28 ℃小室培養，12 h后觀察孢子萌發情況，測定孢子萌發率。

2結果與分析

2.1分離菌株的形態學觀察

分離純化后獲得5株菌株，分別編號為tomato（a）、tomato（b）、tomato（c）、tomato（d）、tomato（e），將這些菌株培養 8 d 即可長滿整個培養皿，該菌的基本形態特征為：在PDA培養基上，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長，菌落最外層為灰白色，邊緣整齊，向內為墨綠色，有較清晰的輪紋；分生孢子梗分隔，有橫縱隔膜，其中橫膈膜1～5個，縱隔膜0～3個，呈棕黃色，常多個呈鏈狀分布；單孢子短卵、橢圓或倒棍棒形（圖1）。根據該菌株的培養形狀及形態學特征，根據相關資料[5-10]，依據《真菌鑒定手冊》的相關描述[11]，初步鑒定為鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]。

2.2生物學特性

2.2.1溫度對菌株生長和孢子萌發的影響

由圖2可知，在4、15、25、28、30、37 ℃中均可生長，其中28 ℃為最佳生長溫度，培養3、6 d后菌落平均直徑達到了30、50 mm，菌落生長速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊。當溫度小于15 ℃或大于37 ℃時，菌落生長明顯受到抑制，菌絲變成灰白色，黑色孢子變少，菌落邊緣分辨不清，菌株有老化跡象；培養6 d后菌落直徑均小于30 mm。當溫度為1、40 ℃時菌株不生長，也無萌發跡象。黑色鏈格孢分生孢子在4～37 ℃范圍內均可萌發，其中4 ℃下培養6 h萌發率最低，為6.0%；28 ℃下培養12 h萌發率最高，為97.6%。當培養溫度小于15 ℃或大于37 ℃時，分生孢子萌發率明顯降低，培養12 h萌發率均低于35.0%；當溫度小于4 ℃或大于37 ℃時，分生孢子則不能萌發。

2.2.2pH值對菌株生長和孢子萌發的影響[12]

由圖3可以看出，番茄黑色鏈格孢菌在pH值為3～12的PDA固體平板培養基中均可生長，當pH值為6時，菌落生長速度最快；當pH值小于4或大于9時，菌株生長明顯受到抑制。pH值為3～10時，培養12 h后平均有62.2%的病原菌孢子可以萌發；pH值為7時，病原菌孢子萌發率最高，培養12 h后萌發率為97.0%；當pH值大于11時，孢子不能萌發。綜合考慮，菌絲生長和孢子萌發的最適pH值選為6。

2.2.3光照條件對菌株生長和孢子萌發的影響

2.2.5不同碳源和氮源對菌株生長和孢子萌發的影響

由圖4可以看出，致病菌在D-木糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖等7種不同碳源查彼固體平板培養基中均可正常生長，28 ℃培養3 d后，菌落平均直徑在23.75～38.00 mm 之間；培養6 d后差異明顯，菌落平均直徑在 37.59～62.50 mm之間。在供試的7種不同碳源培養基中，D-木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖菌落平均生長直徑優于其他培養基；其中，菌落生長狀況最佳的為添加乳糖的查彼固體平板培養基，28 ℃中培養6 d后，菌落平均生長直徑達到 62.50 mm，菌落生長速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊；不加碳源的對照組則不生長。

試驗結果（圖5）表明，菌株在NaNO3、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸等6種不同氮源查彼固體平板培養基中均可正常生長，28 ℃培養3 d后，菌落平均直徑在2500～43.00 mm之間；培養6 d后差異明顯，菌落平均直徑在 32.50～65.50 mm之間。在供試的6種不同碳源培養基中，NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏菌落平均生長直徑優于其他2種培養基；其中菌落生長狀況最佳的為添加酵母膏的查彼固體平板培養基，28 ℃中培養6 d后，菌落平均生長直徑達到65.50 mm，菌落生長速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊；天冬酰胺則會抑制病原菌生長，28 ℃培養6 d后，菌落平均直徑低于40.00 mm；不加氮源的對照組則沒有生長。

2.2.6致死溫度的確定

試驗結果得出，供試菌株分生孢子在40～45 ℃處理5～20 min均可正常萌發；50 ℃處理20 min時萌發率明顯降低，培養12 h后平均萌發率只有11%，且菌絲生長受到影響；65 ℃處理15 min后平均萌發率較50 ℃處理20 min后更低，培養12 h后平均萌發率只有3%；65 ℃處理[CM（25]20[KG*3]min后，病原菌分生孢子不能萌發，由此可知，實驗室供[CM）]

試菌株的致死溫度為65 ℃處理20 min，菌株有耐高溫屬性。

3討論與結論

重點對番茄鏈格孢菌的生長特性進行研究，結果顯示，此菌對PDA固體平板培養基中的營養物質利用率較高，生長速度較快。致死溫度為65 ℃處理20 min；菌株生長和孢子萌發的最適溫度為28 ℃；全黑暗培養下菌落生長速度最快，全黑暗下孢子萌發率最高。根據以上結論可知，此菌株生長特性與正常環境溫度、光照條件相似，所以可以在很短的時間內侵染萌發、生長擴展，與其耐高溫、不喜光、營養選擇上的特性相同。

該菌株喜好偏酸至中性的生長條件，與果肉和果實本身的pH值相近，與報道已知的病原菌一樣，菌株與寄主之間是相互作用的，這種特性有利于菌株本身的生長發育[13-15]，推論其自身代謝物也有可能會對寄主本身的酸堿值造成一定的改變。

番茄鏈格孢菌對碳源、氮源的選擇不苛刻，常見碳氮源均可使其正常生長，沒有規律性可言。對于碳源的選擇上，菌株在等量替換成乳糖的查彼固體平板培養基上菌落生長最快，蔗糖次之。在氮源的選擇上，菌株在等量替換成酵母膏的查彼固體平板培養基上生長最佳；天冬酰胺則有一定的抑制作用。

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