纖維環穿刺結合TNF-α注射構建大鼠尾椎間盤退變模型的實驗研究*

夏炳江張 磊胡松峰王 寧侯明生

（1.浙江省紹興市中醫院，浙江 紹興 312000；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

·研究報告·

纖維環穿刺結合TNF-α注射構建大鼠尾椎間盤退變模型的實驗研究*

夏炳江1，2△張 磊2胡松峰1王 寧1侯明生1

（1.浙江省紹興市中醫院，浙江 紹興 312000；2.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

目的觀察X線透視下纖維環穿刺結合腫瘤壞死因子-α（TNF-α）椎間盤內注射構建大鼠尾椎間盤退變模型的可行性。方法取3月齡清潔級SD大鼠96只，隨機分為空白對照組（A組）、對照組（B組）和實驗組（C組）各32只。C組大鼠在X線透視輔助下，利用0.6mm穿刺針穿刺尾椎5～6椎間隙（Co5/6），穿刺成功后，以微量注射器向椎間盤內注入TNF-α（10 ng/μL）25μL。B組大鼠在椎間盤穿刺成功后注入25μL生理鹽水，A組大鼠不做任何處理。采用50%機械性撤足閾值、椎間隙相對高度、椎間盤組織學改變及椎間盤聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達評價大鼠尾椎間盤退變情況。結果造模后，C組大鼠50%機械性撤足閾值明顯降低，椎間隙相對高度逐漸下降，HE染色顯示椎間盤出現明顯退變表現，椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達下降，表明模型構建成功，與B組大鼠相比，C組大鼠誘發的椎間盤退變過程出現更早，進展更快，程度更重。結論X線透視下纖維環穿刺結合TNF-α椎間盤內注射是一種可行的建立大鼠尾椎間盤退變模型的方法，其所誘發的椎間盤退變過程出現更早，進展更快，程度更重。

椎間盤退變 TNF-α 動物模型 針刺

椎間盤退變性疾?。―DD）因椎間盤退變的病因和病理生理機制尚未完全闡明，故目前尚無理想的治療方法。建立一種合理、規范的椎間盤退變動物模型能夠為研究椎間盤退變發生及發展機制提供有利條件，同時為驗證各種干預措施修復退變椎間盤有效性提供良好的實驗載體。目前，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為一種具有多種生物學效應的細胞因子，在椎間盤退變發生發展中的作用越來越受到重視。大量文獻證實，退變椎間盤組織中TNF-α表達明顯增高［1-2］，且與人類盤源性腰痛的發生密切相關［3］。故本研究擬采用傳統的纖維環針刺法結合外源性TNF-α椎間盤內注射的方法構建大鼠尾椎間盤退變模型，并采用行為學、放射學、組織學及分子生物學等方法評價椎間盤退變情況，以期建立一種穩定，可重復，且與人類椎間盤退變具有類似表現的動物模型?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠96只，12周齡，體質量 （220± 20）g，所有SD大鼠均由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供 （實驗動物號：SYXK-浙-2008-0115），每籠4只，喂食普通顆粒飼料，室溫（20±2）℃，自然光照，保持良好通風，自由進水進食。

1.2 試劑與儀器

Von Frey纖毛儀（美國Stoelting），多光譜小動物活體成像儀（美國Carestream Health），全自動組織脫水機（日本櫻花），輪轉式切片機（德國Leica），顯微鏡及顯微拍攝系統（德國Leica），BI-2000醫學圖像分析系統 （成都泰盟科技有限公司），TNF-α（上海生工），Trizol提取液（上海生工），反轉錄試劑盒（TAKARA，大連），定量試劑盒（TAKARA，大連），PCR引物（上海生工）。

1.3 分組與造模

將96只大鼠，按隨機區組設計原則，隨機分為空白對照組（A組）、對照組（B組）和實驗組（C組）各32只。C組大鼠在X線透視下，采用傳統的纖維環針刺法結合外源性TNF-α椎間盤內注射的方法構建尾椎間盤退變模型，具體方法如下：所有SD大鼠術前禁食6 h，利用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。取仰臥位，在X線透視引導下，利用0.6mm穿刺針穿刺尾椎5/6椎間隙（Co5/6）。當穿刺針進至椎間盤中心后，以微量注射器向椎間盤內注入TNF-α（10 ng/μL）25μL，停留約10 s后出針。術后肌肉注射青霉素10000 U預防感染，持續3 d，分籠常規飼養，自由活動。B組大鼠在椎間盤穿刺成功后注入25μL生理鹽水，其他干預措施同C組大鼠。A組大鼠不做任何處理。

1.4 標本采集及檢測

分別于造模前及造模后相應時間點每組各取8只大鼠測定50%機械性撤足閾值、椎間盤相對高度、椎間盤組織學改變及聚蛋白聚糖與Ⅱ型膠原（Col2）mRNA表達水平。

1.4.1 50%機械性撤足閾值測定 采用經典 “Up-Down”方法測定大鼠造模前及造模后1 d、3 d、1周、2周、4周、6周50%機械性撤足閾值，判定其是否產生病理性疼痛，該閾值與疼痛呈負相關［4］。為消除心理環境因素的干擾，測試前先將大鼠置于測試裝置內1 h，使其適應環境，等待大鼠完全安靜后開始試驗。采用不同強度的von Frey hairs分別對大鼠后足足趾施加機械性刺激，測試時保持von Frey hairs垂直、微彎曲，刺激時間為6 s，期間若大鼠出現快速撤足即為陽性反應。若撤足反應為陰性，則增加1級刺激強度，若撤足反應為陽性，則將刺激強度減小1級。如此反復，以第1個轉折點的前1點為起點，連續6次的刺激結果為最終的撤足反應模式。通過特定的程序將撤足反應模式轉換為相應的撤足閾值。

1.4.2 椎間盤相對高度測量 在造模前及造模后第2、4、6周將大鼠麻醉后，行尾椎X線檢查 （距離6.59英寸；曝光時間19 s；電壓50 kV）。檢查時將大鼠尾保持平直，檢測后即時數字化成像，將影像學資料輸入計算機系統，采用雙盲法對其進行處理。Co5/6椎間盤相對高度測量方法［5］：將椎間盤寬度四等分，測量中點及其兩側各位點相鄰椎體及椎間盤的高度，計算椎間盤高度指數 （DHI）=椎間盤高度平均值/椎體高度平均值，以DHI變化率（DHI%）代表椎間盤高度的變化，即DHI%=術后DHI%/術前DHI%×100%。

1.4.3 椎間盤組織學觀察 在造模前及造模后第2、4、6周將大鼠Co5/6椎間盤（連同上、下部分椎體）用10%磷酸鹽緩沖液甲醛固定72 h，14%EDTA液脫鈣14 d，按常規脫水、透明、包埋、石蠟切片，厚約3～4μm，行常規HE染色，光鏡下觀察椎間盤髓核、纖維環以及交界區的組織學形態。根據纖維環與髓核的退變程度，各自評分（0～3分）。評分標準參考文獻［6］執行。其中1分為輕度退變，2分為中度退變，3分為重度退變。

1.4.4 椎間盤聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達水平檢測 完整切取大鼠Co5/6椎間盤，利用液氮迅速冷凍后將其研磨成粉。利用Trizol提取液提取總RNA，逆轉錄成cDNA，再以合成的cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR所需引物序列［7］見表1。以GAPDH基因作為內參照，測量聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA的表達。上述指標均重復測量2次，取其平均值。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件。多組間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動物一般情況

本試驗中所有SD大鼠均存活，無意外死亡等情況發生。所有SD大鼠造模前均行X線檢查，以排除先天性尾椎畸形及椎間隙狹窄等情況存在。

2.2 各組大鼠造模前后各時間點50%機械性撤足閾值測定結果比較

見表2。造模前各組大鼠50%機械性撤足閾值比較無統計學意義 （P>0.05）。造模后各相應時間點，A組大鼠50%機械性撤足閾值，與基礎閾值比較，均無明顯改變（P>0.05）。B組大鼠50%機械性撤足閾值在造模后第1天下降，造模后第3天有所回升，7 d后維持在穩定水平至造模后6周，與A組大鼠同時間點閾值相比，差異有統計學意義（P<0.05）。C組大鼠50%機械性撤足閾值從造模后第1天開始下降，至第7天降至最低，并保持在低水平至造模后6周，與A組及B組大鼠同時間點閾值相比，差異有統計學意義（P< 0.05）。

表2 各組大鼠造模前后各時間點50%機械性撤足閾值比較（±s）

表2 各組大鼠造模前后各時間點50%機械性撤足閾值比較（±s）

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與造模前1 d比較，△P＜0.05。下同。

造模后組 別 n 造模前1d 1d 3d 1周 2周 4周 6周A組 8 22.32±8.39 23.12±7.43 21.56±8.22 22.54±7.25 23.02±9.34 22.35±8.72 23.48±9.38 B組 8 24.67±9.79 8.34±2.37*△9.16±3.03*△14.34±3.13*△15.76±2.74*△14.66±3.13*△14.17±3.55*△C組 8 23.02±8.62 5.32±1.11*#△4.33±1.45*#△2.04±0.75*#△3.02±0.72*#△2.36±0.64*#△2.53±0.88*#△

2.3 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤DHI%測量結果比較

見表3。造模前各組大鼠DHI比較無統計學意義（P>0.05）。造模后各相應時間點，A組大鼠DHI%，與造模前比較，均無明顯改變（P>0.05）。B組大鼠DHI%在造模后逐漸下降，與A組大鼠同時間點DHI%相比，差異有統計學意義（P<0.05）。C組大鼠DHI%在造模后明顯下降，與A組及B組大鼠同時間點DHI%相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

表3 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤DHI%比較（%，±s）

表3 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤DHI%比較（%，±s）

組別 n 造模前1 d 造模后A組 8 B組 8 2周 4周 6周100 100 100 100 100 80.76±10.32*△70.66±13.16*△70.17±14.22*△C組 8100 60.35±10.72*#△52.33±9.23*#△50.19±10.29*#△

2.4 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤組織學觀察比較

見表4。A組大鼠在造模后第2、4、6周Co5/6椎間盤組織形態學無明顯異常改變，纖維環膠原纖維排列有序，髓核與纖維環界限清晰，髓核組織中間可見較多的脊索細胞和類軟骨細胞，分布均勻。B組大鼠在造模后2周，Co5/6椎間盤組織HE染色呈大致正常椎間盤組織學表現。造模后4周，開始出現纖維環板層狀結構被破壞，髓核呈皺縮狀，髓核細胞數量減少，但髓核內仍可見細胞結構和規律的細胞。C組大鼠在造模后2周即開始出現纖維環排列紊亂、裂隙及斷裂，纖維環與髓核交界區變窄，髓核組織被破壞，其中部分髓核組織被成纖維結締組織取代。

表4 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤HE染色評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6椎間盤HE染色評分比較（分，±s）

組別 n 造模前1 d 造模后A組 8 B組 8 2周 4周 6周0 0 0 0 0 1.00±0.71*△2.40±0.89*△3.00±1.22*△C組 80 3.24±0.83*#△3.84±0.84*#△4.80±1.30*#△

2.5 各組大鼠造模前后各時間點Co5/6蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達水平檢測結果比較

見表5。造模前各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA比較差異無統計學意義（P>0.05）。造模后第2、4、6周，B組與C組大鼠蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA，與造模前比較，均有明顯下降（P<0.05），其中C組大鼠蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA下降更明顯，與B組大鼠同時間點相比，差異有顯著統計學意義（P<0.05）。

表5 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達比較（±s）

表5 各組大鼠Co5/6椎間盤蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA表達比較（±s）

組別 造模前1 d 造模后2周 4周 6周A組 1.10±0.20 1.13±0.28 1.22±0.25 1.18±0.23（n＝8） 1.05±0.08 1.10±0.10 1.11±0.09 1.07±0.11 B組 1.21±0.24 0.70±0.07*△0.74±0.05*△0.62±0.03*△（n＝8） 1.08±0.07 0.74±0.06*△0.63±0.07*△0.61±0.02*△C組 1.02±0.21 0.54±0.02*#△0.50±0.04*#△0.52±0.03*#△（n＝8） 1.11±0.11 0.48±0.05*#△0.40±0.06*#△0.42±0.02*#△

3 討 論

3.1 椎間盤退變模型構建方法

建立的椎間盤退變動物模型要求與人類的椎間盤退變具有相似性和可比性，應能再現椎間盤退變的客觀規律，可重復，且所選動物的解剖結構與生理特點盡可能與人類接近，同時，應考慮經濟因素和操作可行性［8］。目前利用大鼠建模較多，價格相對低廉、飼養方便，雖然其椎間盤較小，但解剖結構及生化成份與人類椎間盤相近［9］。在本實驗中，作者采用SD大鼠來構建椎間盤退變模型。

纖維環損傷法是目前最常采用的椎間盤退變造模方法，其中以針刺纖維環造模法應用較廣泛［10］。目前，TNF-α表達增高是椎間盤退變及下腰痛的重要病理生理學特征［11-12］。

本研究采用在X線透視下纖維環穿刺聯合外源性TNF-α椎間盤內注射的方法來建立大鼠尾椎間盤退變模型。該法建立的椎間盤退變模型最大的特點是使用存在于退變椎間盤內的細胞因子TNF-α，能夠更好的模擬椎間盤退變的病理生理過程，與單純纖維環穿刺法相比更接近椎間盤退變的客觀規律。

3.2 模型退變的效果評估

3.2.1 疼痛行為學 與椎間盤正常生理性衰老不同，病理性椎間盤退變的重要特征是可誘發疼痛，故對椎間盤退變模型進行疼痛評估，顯得非常重要。在本研究中，筆者發現造模大鼠50%機械性撤足閾值從造模后第1天開始下降，至第7天降至最低，并保持在低水平至造模后6周，與A組及B組大鼠同時間點閾值相比，差異有統計學意義。由此，我們認為模型大鼠疼痛閾值降低，與臨床椎間盤退變誘發疼痛現象類似，故該模型有助于研究和評估新藥物或治療技術緩解盤源性疼痛的療效。

3.2.2 影像學指標 椎間盤組織在X線上雖然無法直接顯示，但仍可通過間接觀察椎間隙高度及椎緣骨質改變來推測椎間盤的變化，以判斷椎間盤退變的嚴重程度［13］。既往研究已證明在X線片上測量到的椎間隙高度改變與椎間盤的組織病理學、免疫組織化學檢測結果有較高的相關性［14］。在本研究中，筆者觀察到大鼠椎間隙在造模后明顯下降（P<0.05），提示造模后椎間盤出現明顯退變。與單純穿刺法相比，C組大鼠椎間隙高度丟失更早、更快及更嚴重，提示X線透視下纖維環穿刺結合TNF-α椎間盤內注射是一種可行的建立大鼠尾椎間盤退變模型的方法，其所誘發的椎間盤退變過程出現更早，進展更快，程度更重。

3.2.3 組織形態學 通過HE染色和其他不同的特殊染色對椎間盤組織進行評價分析是目前評估椎間盤退變最準確的方法。當椎間盤發生退變時，纖維環，髓核及軟骨終板均會出現相應的病理改變［15］。在本研究中，大鼠在造模后2周即開始出現纖維環排列紊亂、裂隙及斷裂，纖維環與髓核交界區變窄，髓核組織被破壞，其中部分髓核組織被成纖維結締組織取代，提示椎間盤退變模型建立成功。此外，我們研究亦發現，與單純穿刺法相比，聯合應用TNF-α椎間盤內注射可更快誘導椎間盤出現退變。

3.2.4 分子生物學 研究表明，椎間盤退變是由細胞外基質的合成代謝與分解代謝的動態平衡被打破造成的，其中分解代謝因素更重要［16］。聚蛋白聚糖是椎間盤中蛋白多糖的主要類型。聚蛋白聚糖的降解，被認為是軟骨退變早期的重要指標。聚蛋白聚糖降解可致后續的Ⅱ型膠原纖維降解，后者在穩定椎間盤自身結構及對抗外界壓力負荷上具有重要的作用［17］。本研究發現，造模大鼠聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原mRNA明顯下降，與對照組大鼠同時間點相比，差異有顯著統計學意義，這些改變與人類椎間盤退變的病理過程與生化改變規律類似。

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An Experimental Study of the Construction of Caudal Intervertebral Disc Degeneration M odel in Rats by Anulus Fibrosus Puncture Combined w ith TNF-αInjection

XIA Bingjiang，ZHANG Lei，HU Songfeng，etal.Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Shaoxing 312000，China.

Objective：To study the feasibility of the construction of caudal intervertebral disc degeneration model in rats by anulus fibrosus puncture combined with TNF-αinjection.M ethods：96 SD rats were divided randomly into the blank group（group A，n=32），the control group（group B，n=32）and the experimental group（group C，n=32）.In group C，the coccygeal intervertbral discs in rats at Co5-6 were punctured by 0.06 mm needle and

25μL of TNF-α（10 ng/μL）.In group B，the coccygeal intervertbral discs in rats at Co5-6 were punctured by 0.06 mm needle and received 25μL normal saline.In group A，no interventions were taken.The caudal intervertebral disc degeneration was evaluated by 50%mechanicalwithdrawal threshold，intervertebral disc relative height，intervertebral disc histological changes and intervertebral disc proteoglycan and collagen typeⅡgene expression.Results：Aftermodeling，the 50%mechanicalwithdrawal threshold decreased；intervertebral disc relative height reduced；intervertebral disc histological changed，HE staining showed visible disc degeneration；the gene expression of proteoglycan and collagen type II intervertebral disc decreased.All these showed the model was successful.Compared with group B，the process of intervertebral disc degeneration in group C appeared earlier，faster，and more serious.Conclusion：In X-ray fluoroscopy，anulus fibrosus puncture combined with TNF-α injection is a feasiblemethod for the establishment of caudal intervertebral disc degeneration model in rats.The process of intervertebral disc degeneration induced by thismethod appeared earlier，faster，and more serious.

Intervertebral disc degeneration；TNF-α；Animalmodel；Needle puncture

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1167-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.011

2017-03-29）

浙江省紹興市科技計劃項目（2015B70060）；浙江省中醫藥科技計劃項目（2016ZB132）

△通信作者（電子郵箱：xiabj2006@163.com）