重組人血白蛋白工業應用研究進展

王宗太　馬寧寧

[摘要]人血清白蛋白（HAS）在人血漿中的含量最為豐富，是蛋白質的一種，在血漿總蛋白中所占約60%的比重，生理功能不僅重要，而且較多，同時其也是制藥工業中最為重要的一種原輔助料。當前市場中銷售的HSA大部分為提取與人血漿，但是血液的隱藏風險較大，這就使得基因重組人血清蛋白（rHSA）成為HSA的首選替代品。本文重點介紹了重組人血清白蛋白在工業生產上應用的研究進展。

[關鍵詞]重組白蛋白；細胞培養；藥用輔料

[中圖分類號] R977.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（a）-0011-04

The pharmaceutical application research progress of industrial production of Human serum albumin

WANG Zong-tai1，2 MA Ning-ning1

1.Shenyang Pharmaceat：cal University，Liaoning Province，Shenyang 110016，China；2.Biotechnology Branch of worth China Phanmacetice co，Lal，Hebei Province，Shijiazhoang 056215，China

[Abstract]Human serum albumin（HAS） is the most abundant in human plasma，is a protein，in the plasma total protein accounted for about 60% of the proportion of physiological function is not only important，but also more，but also the pharmaceutical industry The most important of a kind of raw auxiliary materials. Most of the HSA sold in the current market is extracted with human plasma，but the risk of blood is greater，which makes the recombinant human serum albumin（rHSA） a preferred alternative to HSA.The pharmaceutical application research progress of industrial production of rHSA were reviewed in this article.

[Key words]Recombinant albumin；Cell culture；Excipient

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中最豐富的蛋白質，占血漿總蛋白的50%～60%[1]。HSA屬于一種單鏈無糖基化蛋白質，組成為585個氨基酸，分子量是66.5 kD，等電點介于4.7～4.9。整個分子盤旋成心型，其三維結構如圖1所示。

圖1 人血清蛋白分子結構圖

HAS具有廣泛的臨床應用和工業應用，國內主要生產廠家有成都蓉生、山東泰邦、華蘭生物、四川遠大蜀陽、山西康寶、上海生物制品研究所、上海萊士等。2015年國內批簽發HAS約323噸，自2012年起連續四年增長率保持在10%以上，且由于血漿的短缺，進口產品約占58.7%，國內市場供應始終處于緊張狀態。同時，HSA的市場售價相對較高，最高可達每克40元，進而導致我國各大醫院的HSA儲備量告急的情況，國家也不得不制定多種限制性較強的措施改善現狀。這也間接導致了HSA的黑市高價交易等畸形銷售現象。人們生活水平的額提升導致血液資源愈發緊張，HSA的緊缺情況也沒有良好的改善，形勢嚴峻?，F階段，臨床及市場中大量應用的HSA的提取制備方法是低溫乙醇法（Chon）與柱層析法[2-3]，被提取物為人類血漿。然而，人類血液中存在慢性乙肝、艾滋病等傳染性疾病因子的可能性較大，且即使經過純化工藝也難以保證不會將病毒帶入產品中；另一方面血液供應也有限，特別是近年來生物醫藥快速發展，人血白蛋白作為工業原輔料的需求量越來越大，使本來臨床短缺的白蛋白更是雪上加霜，因此，尋找血液替代品迫在眉睫。

1 HAS的發展

1981年，Genentech公司的Lwan及另外幾位員工首次對重組人血蛋白（rHSA）CDNA序列進行了專業性報道，并且第一次應用色氨酸（Trp）啟動子。色氨酸引導源于質粒pBR322的TC一和AmP基因，其共同構造出全球首個rHSA表達載體Phsai，并取得了其在大腸埃希菌中的成功表達。30多年來，國際上許多實驗室和公司都嘗試通過遺傳工程開發rHSA，且已經取得了突破性進展，國內外研究現狀見表1。

華北制藥經過十幾年的技術研發，構建了穩定、高效分泌表達基因工程菌，擁有菌種構建、發酵、純化等完整的自主知識產權，其中，純化工藝專利在十三個國家獲得授權。2011年建成符合cGMP生產線，產業化能力6噸/年，發酵單位達10 g/L以上，產率20%以上。相比由血漿提取HSA，采用基因重組技術生產rHSA，有明顯優勢：①嚴格按照生物制品標準，強大的工藝穩定性，很好的批次均一性；②純度控制標準高于藥典對HSA規定，純度高達99%以上；③熱原優勢更明顯，內控標準遠高于國家藥典對血源性HSA的規定；④具有血源HSA一致的氨基酸組成，有相同的理化特性；⑤無任何動物來源成份，遠離血源性病毒污染，rHSA更安全；⑥原輔料沒有制約，產量能滿足市場供應。目前國內僅有華北制藥具備了產業化條件，但是rHSA的工業應用尚處于前期，市場還在逐步培育，6噸/年產能還沒有完全釋放，按照目前的技術指標，滿產后的成本相比HAS具有非常強的市場競爭力（圖2）。

圖2 工藝流程框圖

華北制藥研制的rHSA具有與血源白蛋白相同的結構、理化特性。近年來，有越來越多的關于rHSA非治療作用的應用研究報道，如用于細胞培養促進劑、蛋白類藥物穩定劑、藥物和基因轉運載體、化妝品添加劑等。

2作為培養基的重要組分促進細胞正常生長

rHSA在動物細胞及胚胎培養中的生理功能較多[4]，能夠作為自由基清除劑、重金屬螯合劑、穩定劑、表面活性劑以及營養物進行使用。它還可與維生素或激素等藥物相結合，進而進入動物細胞中，提升細胞的生長速度，消除毒素以及蛋白酶等物質，減少其對細胞生長的不良影響。

2.1支持低密度CHO細胞生長

生命科學近年來發展迅速，哺乳動物細胞在生命科學中發揮著重要作用。動物源血清營養豐富，是細胞培養的良好培養基，但是動物源血清具有潛在的風險，是監管的難題。為證明rHSA聯合化學成分確定的培養基能夠支持低密度細胞的生長，Zhu等開展了細胞培養試驗，結果表明在培養基中添加適當比例的rHSA，能有效支持低密度CHO細胞的生長[5]。

2.2對Vero、HKC細胞的促生長作用

在狂犬疫苗的生產過程中，無論是使用Vero細胞還是HKC細胞培養，在基礎培養基中添加適當比例的HSA能夠顯著促進細胞生長，從而提高病毒表達。利用生物技術生產的rHSA與HSA具有相同的結構和理化特性，理論上應該對同等細胞的生長具有與HAS相同的促進作用。我們開展了大量的對比試驗：針對Vero細胞[6]、HKC細胞等細胞，利用的培養基分別含相同比例的HAS和rHSA。試驗結果證實，rHSA與HAS一樣對Vero、HKC細胞有促生長作用。

2.3 rHSA在低溫貯藏和細胞復蘇方面的作用

生物制品生產過程中及細胞庫中廣泛利用冷凍技術進行種子細胞的保存。用rHSA以培養基組分的形式進行細胞凍存，其效果與胎牛血清的作用相似，相比市面上常見的冷凍劑，rHSA對細胞增長的維持以及存活作用更為理想。通過用rHSA替代胎牛血清進行低溫貯藏和復蘇的研究[7]，表明rHSA應用于細胞低溫貯藏是可行的。

3作為輔料是蛋白或肽類藥物的良好穩定劑

在實際藥物以及生物制品的生產工作中，為提升其穩定性需添加一定量的穩定劑。HSA作為穩定劑現被廣泛應用于當前市場銷售的生物制劑中，其用量介于0.1%～0.2%。其被用作穩定劑的原因包括：①rHSA的穩定性良好，溶解性較為理想；②rHSA可以阻斷蛋白質對容器壁的吸附。因此，rHSA在疫苗等制品中的應用率較高。血源HSA具有被污染的風險，也會因為其結構差異、生產批次不穩定等原因出現各種問題，因此，rHSA有望代替HSA作為藥物穩定劑[8]。美國FDA將rHSA作為藥用輔料已經收載入藥典，默克公司利用rHSA為輔料的麻腮風三聯疫苗已經獲得美國FDA批準上市。

3.1抗氧化作用

rHSA具有一定的抗氧化作用，該作用的存在于其分析結構之間關系密切。rHSA中存在的大量點位均具有良好的抗氧化活性[9]。比如，rHSA中存在的自由半胱氨酸殘基Cys-34是一種還原性巰基，對rHSA發揮抗氧化功能具有重要作用。rHSA中含有6個蛋氨酸殘基，該物質上也有一定的巰基，對氧化作用具有高度敏感性，并在發生氧化作用后產生蛋氨酸亞砜殘基。長鏈脂肪酸結合于rHSA中的Lys-351、Lys-475、Arg-117對脂肪酸有良好的保護作用，可減少自由基對其的攻擊。同時，rHSA的Lys-240與膽紅素相結合后，會對脂質過氧化進行良好抑制。

3.2增強藥物的靶向性及安全性

增強藥物的靶向性對藥物有效性以及安全性的提升均有重要意義。HSA是抗腫瘤藥物的主要載體，其具備載藥量高、穩定性好、緩釋靶向的特點[10]。2005年FDA批準APP公司的以HSA為載體的紫杉醇產品Abraxane上市， Abraxane具有勝過紫杉醇注射液的顯著優點。rHSA也同樣可以作為一種藥物載體，通過不同的方式使藥物的靶向性得到增強。一方面，藥物可以制作成rHSA的納米制劑，就可以減少藥物的毒副作用，提高有效性。另一方面通過對rHSA加以修飾后，使其與靶蛋白結合配體以及藥物相連接，促使藥物實現靶向作用。

3.3藥物傳輸系統中的載體

rHSA是人體血腦屏障運輸載體，同時也轉運非入侵性基因。一般來說，人體內的蛋白質以及肽類藥物滲入血腦屏障的難度很大，但是嵌合肽的應用則能夠將上述兩類藥物轉運至血腦屏障內。無法進行轉運的肽類藥物能夠和血腦藥物的運載體共同形成一種嵌合肽[11]，而已經被陽離子化的rHSA中存在的氨基酸基團能夠與多種化合物相結合。其與血腦屏障內皮中存在的多糖蛋白復合物產生靜電作用，而陽離子化白蛋白-β-內啡嵌合肽就會借助介導細胞的轉運作用進入大腦組織中。

3.4藥物在體內半衰期被延長

HSA具有增加被結合蛋白分子質量，保護被結合蛋白的作用，當其與多肽類藥物或者蛋白質結合后，會使其在人體內的半衰期有顯著延長現象。糖尿病的臨床治療中，胰島素是常用藥物之一，但因其生物半衰期相對較短，因此需要增加用藥頻率以保證療效。Dut-taroy等在研究中，將單鏈人胰島素基因以及HSA二者相融合，最終獲得半衰期較長的胰島素，減少了給藥頻率[12]。另外，有研究中將馬來酰亞胺衍生物與HSA相結合，進而獲得半衰期較長的胰島[13]。

4 rHSA的其他應用

4.1 rHSA突變體

臨床中主要通過光線療法對新生兒科黃疸疾病以及Ⅰ型Crigler-Najjar綜合征予以治療，而光線療法結合重組白蛋白后再使用可快速有效的降低血清中尚未結合的膽紅素水平。Crigler-Najjar綜合征治療的過程中，最為關鍵的治療點在于維持膽紅素濃度，一般在20.0 nmol/L左右。除此之外，還需要保證膽紅素整體濃度不能超過HSA的整體結合水平[14-15]。當光線療法與rHSA相結合應用時能夠將膽紅素進行溶解，使其成為無毒性異構體之一。有相關研究結果顯示，改異構體的構成及構成速度和與rHSA結合的膽紅素構象、電子環境關系緊密，因此產生的rHSA突變體能夠在短時間內產生大量具有較強可溶性的膽紅素光合物，其與野性HSA相比，在提升光線治療效果中價值更高[16]。同時，rHSA突變體能夠作為一種體外解毒劑作用在白蛋白透析中。

4.2 rHSA應用于化妝品領域中的分析

由于rHSA的特性，其在化妝品領域是被作為水溶性蛋白而應用的，是一種中性緩沖液，其生物兼容性十分良好，其應用于人體皮膚表面時，會在上面覆蓋一層具有保護作用的薄膜，對去除皺紋、細紋具有良好的作用，同時還能夠讓使用者的皮膚變得更加透亮嫩滑[17]。在化妝品領域中，rHSA常以活性化合物被應用于各種化妝品中，相對來說，洗劑和霜劑中的rHSA含量較高，使用者通過洗劑和霜劑的應用來吸收rHSA，以此對肌膚進行調理。白蛋白純化液對面部皮膚因老化而產生的魚尾紋具有迅速的消除功效。在美國的一家化妝品公司，NEW CENTURY申請了一項專利，其主要內容為在該公司旗下的面霜、肥皂、洗發露等洗護產品中添加一定量的rHSA，使其在應用過程中能夠吸附在使用者的皮膚以及頭發表面，發揮其組織修復作用，快速修復使用者受損發質以及肌膚，同時rHSA作為活性成分具有減少過敏反應的作用[18]。例如，在洗發產品中添加適量的rHSA會減緩患者頭皮發癢的感覺，消除頭皮屑。而在國內專利中，一種具有保濕、防裂、改善皮膚粗糙暗沉的潤膚霜中添加了甘草提取液、甘油成分以及rHSA后，使其上述功效得以最大發揮。

4.3在醫療器械方面的應用

rHSA與聚乙二醇（PEG）組成聚合物水凝膠已經成為醫療器械領域里的新成員，當這兩種成分結合時，快速的交聯反應產生水凝膠基質，具有強固的黏附性，這項技術讓外科醫生針對患者的胸腔手術，肺部漏氣癥狀等可以進行更有效的手術。目前國內外許多公司正努力將此技術的應用平臺擴展到脊柱、普通外科和婦產科等臨床領域。國外Neomend公司應用諾維信生產的rHSA制造了應用于外科手術的密封膠ProGEL？誖LATINUM，已獲得歐盟CE標識。自2010年4月起，該技術已在美國8000多病例中得到應用。

5展望

HSA是常用的臨床藥物，也廣泛應用于生物藥物的工業生產，可作為細胞培養基的重要組分、蛋白質類藥物或肽類藥物的穩定劑、藥物傳輸系統中的載體等等。隨著現代DNA重組技術、大規模培養和純化技術的發展，國際、國內都實現了rHSA大規模產業化，且研究結果表明產品結構、性質與HAS無明顯差異。rHSA作為臨床用藥、藥用輔料、細胞培養基組分在國外都有廣泛應用，國內的相關研究也都取得了實質性的進展。rHSA替代HAS具有廣泛的社會意義，也是生物技術發展的必然趨勢。

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（收稿日期：2017-05-21 本文編輯：崔建中）