常山堿穩定性及其降解動力學研究

張繼遠 劉曉謙 楊立新 馮偉紅++王智民++李春

[摘要]對常山堿的穩定性及其降解動力學進行研究。結果表明，24 h內流動相作溶劑時，常山堿含量僅降低1%，但在水、甲醇、50%甲醇及10%乙腈溶液中其含量降低為起始含量的90%。當溶液pH介于3～7時，24 h內常山堿的保留率在98%以上，但在堿性溶液中（pH 90）含量降低約12%。溫度越高，常山堿穩定性越差，40～80 ℃放置10 h后，常山堿降為起始含量的60%左右，但在20 ℃下放置10 h，其含量僅降低約5%；40，60 ℃放置10 h，常山堿主要轉化為異常山堿，二者的總含量較起始總含量基本不變，但是80 ℃下放置10 h，常山堿和異常山堿的總含量降低為起始總含量的8333%，說明高溫下常山堿結構發生了徹底改變，而不僅僅是異構化為異常山堿。光照對常山堿穩定性影響顯著，強光照射108 h，常山堿質量分數較起始含量降低23%左右，但在避光和自然光條件下，其含量僅降低10%左右。無論在人工胃液（pH 14）還是人工腸液（pH 68）中，放置10 h后，常山堿質量分數降低均小于5%。常山堿固體在高溫（60 ℃）、高濕[（75±1）%]和強光（3 000 lx）照射下放置10 d后，其含量分別減少027%，76%，539%。常山堿在水、甲醇、50%甲醇和10%乙腈溶劑中、堿性溶液、不同光照和不同溫度（20，40 ℃）下的降解基本符合化學動力學一級反應。因此，無論是常山堿的制備純化還是相關制劑的生產，都應在偏酸性溶液，低溫、避光條件下快速操作完成，而常山堿固體則應在干燥、避光條件下保存。

[關鍵詞]常山堿；穩定性；高效液相色譜法

Investigation on stability and degradation kinetics of febrifugine

ZHANG Jiyuan1，2，3， LIU Xiaoqian2，3， YANG Lixin2，3， FENG Weihong2，3， WANG Zhimin2，3*， LI Chun2，3

（1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2. China Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China）

[Abstract]To investigate the stability and degradation kinetics of febrifugine The results showed that within 24 hours， febrifugine content was decreased by only 1% in mobile phase solvent， but its content was decreased to be 90% of the initial content in the water， methanol， 50% methanol and 10% acetonitrile solution When the pH value of the solution was between 3 and 7， the retention rate of febrifugine in 24 hours was over 98%， but its content was decreased by about 12% in alkaline solution （pH 90） The higher the temperature， the worse the stability of febrifugine At 4080 ℃， the content of febrifugine was decreased to be 60% of its initial content in 10 hours， but the content was decreased by only 5% in 10 h at 20 ℃However， no matter 40 ℃or 60 ℃， febrifugine was mainly transformed into isofebrifugine， and the total content of febrifugine and isofebrifugine was equal to their initial total content in 10 hours， while incase of 80 ℃， the total content was decreased to be 8333% in 10 h， which suggested that the structure of febrifugine was absolutely changed， not just isomerized to be isofebrigugine at high temperature Light had a significant impact on the stability of febrifugine Under bright light， the content of febrifugine was reduced by about 23% in 108 h， but it only decreased by about 10% in the natural light or darkness In artificial gastric fluid （pH 14） and artificial intestinal fluid （pH 68）， the content of febrifugine was decreased by less than 5% in 10 h After storage at high temperature（60 ℃）， high humidity [（75±1）%] and strong light （3 000 lx） conditions for 10 d， the content of solid febrifugine was decreased by 027%， 76% and 539%， respectively The degradation of febrifugine basically complied with the firstorder reaction kinetic process in the following conditions： in water， methanol， 50%methanol and 10% acetonitrile solvents， alkaline solution （pH>7）， different light intensity and different temperatures （20，40 ℃）. Therefore， no matter the isolation and purification of febrifugine or the production of the related preparations， it should be done fast in the acidic solution， low temperature and dark conditions， while the febrifugine solid should be kept in dry and dark conditionsendprint

[Key words]febrifugine； stability； HPLC

常山堿是從中藥常山Dichroa febrifuga Lour中分離制備出來的單體成分，是一種喹唑酮類生物堿，分子式C16H19O3N3，相對分子質量301。常山為虎耳草科植物常山D febrifuga的干燥根，是我國著名的截瘧祛痰藥，臨床主要用于治療瘧疾[1]。研究發現常山中的常山堿（febrifugine）和異常山堿（isofebrifugine）是其抗瘧的主要活性成分。常山堿和異常山堿性是一對同分異構體，在加熱、酸、堿及不同溶劑中都易發生異構化改變[2]。但是，常山堿和異常山堿的活性卻有很大不同，據文獻報道[3]在雞瘧實驗中，常山堿的抗瘧活性約為奎寧的50倍，而異常山堿的抗瘧活性約與奎寧相當。而且，近年來發現常山堿及其衍生物具有良好的抗腫瘤、免疫增強、促進傷口愈合以及治療糖尿病、硬皮病等的作用[45]，這些研究結果說明常山堿具有廣闊的應用前景。因此，保證常山堿的穩定性阻止其發生轉化對于常山堿的應用具有至關重要的意義。雖然20世紀50年代就分離得到常山堿單體，但有關其穩定性的研究只在早期的文獻[2]提到在一定條件下可與異常山堿發生互相轉化，至今未見詳細的文獻報道。本文以自制常山堿樣品為研究對象，考察了常山堿在不同溶劑、不同pH溶液、不同溫度、不同光照強度，及在人工胃液和人工腸液中的穩定性，還考察了常山堿固體在高溫、高濕和強光下的穩定性，并通過研究常山堿的穩定性，推導其降解動力學方程，研究結果可為常山堿的制備及相關制劑的生產提供參考。

1材料

11儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司），包括LPG3400分析泵、WPS3000SL自動進樣器、TCC300柱溫箱和DAD3000二極管陣列檢測器。Shimadzu LC20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC20AT溶液傳輸單元、SIL20 A 自動進樣器、SPDM20 A 二極管陣列檢測器和LC solution色譜工作站。雙壓線性離子阱串聯高分辨質譜OrbitrapVelos Pro（Thermo Fisher 公司），Ultimate 3000 超高效液相色譜儀（美國戴安公司）。布魯克AⅢ 600 Ascend超導核磁共振儀（瑞士布魯克公司）。MettlerDSC 1 System差示掃描量熱儀（瑞士）。XS105DU型1/10萬天平（瑞士，梅特勒托利多公司），KQ250DB超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司），SevenEasy S20臺式pH酸度計（上海，梅特勒托利多公司），YB2型澄明度檢測儀（天津瑞來特儀器有限公司）和WDA藥物穩定性檢查儀（天津鑫洲科技有限公司）。

12試劑

甲醇和乙腈為HPLC級（美國Fisher公司），水為純凈水（屈臣氏集團香港有限公司），氨水、三乙胺、冰醋酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸和磷酸氫二鈉均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），胰酶（批號F20060707）和胃蛋白酶（批號20160706）均為生化試劑（北京奧博星生物技術有限責任公司）。

13對照品

常山堿對照品（批號151123，HPLC純度≥98%）和異常山堿對照品（批號160114，HPLC純度≥ 98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司。

2方法與結果

21自制常山堿樣品純度分析

211常山堿的制備常山藥材粗粉，20倍量90%乙醇浸泡3 d，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，剩余水液用氨水調節pH至10左右，氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，回收溶劑得浸膏。氯仿浸膏經反復硅膠柱色譜，氯仿甲醇（10∶0～9∶1）梯度洗脫，得常山堿粗品，無水乙醇反復重結晶，得常山堿。

212常山堿的結構鑒定白色針晶；mp：1854 ℃；HRESIMS m/z 302150 2 [M+H]+（計算值302149 9，C16H20O3N3）。氫譜和碳譜數據見表1，經與文獻[6]對照，確定該化合物為常山堿。

214對照品溶液的制備取常山堿對照品2份，每份約10 mg，精密稱定，加流動相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。取異常山堿對照品適量，精密稱定，加流動相溶解制成每1 mL含103 mg的溶液，即得。

215供試品溶液的制備取常山堿樣品3份，每份約10 mg，精密稱定，加流動相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。

216測定結果實驗人員共采用2 種色譜儀進行純度分析試驗。在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間至少3倍。在225 nm 下，除主峰外，可見雜質峰檢出，按峰面積歸一化法計算，純度分別為9422%，9504%，9757%，9241%，9354%，9538%，均值（n=6）為9469%，RSD為19%。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，制成1%自身對照溶液。精密吸取1%自身對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算1%自身對照純度分別為9391%，9493%，9877%，9061%，9210%，9488%，均值（n=6）為9420%，RSD為30%。

22常山堿保留率的計算

取常山堿對照品適量，精密稱定，用流動相溶解制成質量濃度為106 mg·L-1的溶液，作標準曲線并計算回歸方程為y=61048x+0331 7（R2 =0999 7）。用上述方法分別測定常山堿水溶液處理前和經各種處理后的質量濃度，計算常山堿的保留率。常山堿保留率=ρt/ρ0×100%，其中，ρt為處理后t時刻常山堿的質量濃度（g·L-1），ρ0為處理前常山堿的質量濃度（g·L-1）。endprint

23常山堿降解動力學研究

對常山堿的穩定性研究可看作常山堿在溶液中的降解反應，可表示為：A→B+C+D+X，即d[A]/dt=-K[A]n，當t=0 h時，[A]的質量濃度為ρ0，當t時，[A]的質量濃度為ρt；若按一級反應處理（n=1），則ρt=ρ0exp（-Kt），ln（ρt/ρ0 ） =-Kt，以 ln（ρt/ρ0 ）-t作圖，若為線性，則證明反應為一級反應，該直線的斜率為速率常數K。若為一級反應，根據t1/2=0692/K，計算常山堿的半衰期。

若測定得到不同溫度下的速率常數，可根據化學動力學中阿累尼烏斯經驗公式[7]，K=Ae-Ea/RT，其對數形式為lgK=-Ea2303RT+lgA，活化能Ea的計算：lg（K2/K1）=-Ea2303R（1T2-1T1），計算活化能Ea。

24不同溶劑中常山堿的穩定性研究

取常山堿樣品5份，每份約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，分別加入水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈和流動相溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含100 μg的樣品溶液，常溫（25 ℃）下分別于樣品制備后第0，1，2，4，6，8，10，12，24 h進樣，測定樣品溶液中常山堿的質量濃度。結果見表2，3。

表2顯示24 h后，常山堿在水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈中都減少了約12%左右，而在流動相里卻只減少了約1%，說明常山堿在流動相中更穩定。表3結果說明常山堿在水、50%甲醇、甲醇和10%乙腈中都基本符合一級反應（R2≥081，即相關系數r≥09），而其在流動相中的反應不屬于一級反應。從半衰期上也可看出常山堿在流動相中最穩定，而在甲醇中降解最快。

25不同pH常山堿水溶液的穩定性研究

取常山堿樣品適量，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含308 μg的樣品溶液。精密量取4份已配好的常山堿水溶液各1 mL，置10 mL棕色量瓶中，分別用pH為30（實測pH 279）、50（實測pH 554）、70（實測pH 724）和90（實測pH 875）的磷酸氫二鈉（02 mol·L-1）檸檬酸（01 mol·L-1）緩沖溶液定容至刻度，搖勻，避光、室溫下放置。分別于樣品制備后第 0，2，4，6，8，10，12，24 h 取樣，液相色譜條件下測定，記錄不同pH下放置不同時間后樣品溶液中常山堿的質量濃度。結果見表4，5。

由表4可以看出常山堿在酸性和中性溶液更穩定。在酸性和中性環境中放置24 h后，常山堿的保留率都在98%以上；而在pH為875的堿性溶液中，室溫避光放置24 h后常山堿相對含量降為最初的884%。表5顯示在堿性溶液中，常山堿的降解基本符合一級反應，而且在堿性條件下常山堿降解最快。結果提示，在提取分離制備常山堿對照品或者制備常山堿制劑時要盡量在酸性和中性環境下進行。

26不同溫度下常山堿水溶液的穩定性研究

取常山堿樣品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，用水溶解并制成每1 mL含846 μg的樣品溶液。取上述溶液分裝在2 mL的棕色口服液瓶中，密封保存。在避光條件下將上述樣品溶液分別置于20，40，60，80 ℃恒溫水浴鍋中，并分別于放置后第 0，2，4，6，8，10 h取樣，迅速冷卻，HPLC測定不同溫度下放置不同時間后樣品溶液中常山堿的質量濃度。結果見圖2，表6～8。

表6和表8均顯示在20～60 ℃內隨著溫度的升高常山堿的降解速率逐漸加快，在60 ℃時常山堿的降解最快，而在80 ℃時降解速率又低于60 ℃的降解速率。常山堿和異常山堿為同分異構體，可能在60 ℃時常山堿最易轉化為異常山堿。由圖2和表7可看出常山堿在加熱過程中有部分轉化為異常山堿，但隨著溫度的升高，二者的總量在減少，說明

隨著溫度升高常山堿的結構發生了永久的改變，而不僅僅是轉化為異常山堿的可逆性改變。表8顯示，常山堿在20，40 ℃下降解反應基本符合一級反應，而60，80 ℃下不符合一級反應，溫度升高常山堿迅速轉化或者降解。常山堿在水溶液中降解反應活化能Ea為3653 kJ·mol-1，一般化學反應活化能在40～100 kJ·mol-1，小于40 kJ·mol-1為快反應，常山堿在的水溶液中降解反應活化能Ea為3653 kJ·moL-1，為快反應，說明溫度對常山堿的穩定性影響較大。

27不同光照強度下常山堿水溶液的穩定性研究

取常山堿樣品適量，精密稱定，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含894 μg的樣品溶液。從樣品溶液中等量取3份，每份15 mL，置于25 mL量瓶中，密封備用。將上述3份樣品溶液分別置于暗室、日光下和澄明度檢測儀（光照強度3 000 lx）中，作為避光、自然光和強光照射處理條件。在樣品溶液放置后第0，12，24，36，72，84，96，108 h進樣，測定樣品溶液中常山堿的質量濃度。結果見圖3，表9，10。

由表9可知，光照對常山堿水溶液的影響明顯，強光照射下常山堿水溶液的穩定性最差，108 h后常山堿損失率達到24%左右；避光和自然光下的區別不大，常山堿損失率在10%～14%。圖3顯示

強光條件下常山堿主要轉化為異常山堿。表10顯示，無論是強光、自然光還是避光條件下，常山堿的降解都基本符合一級反應，由半衰期可看出，常山堿水溶液在避光條件下最穩定。以上結果提示常山堿在分離純化過程中應盡量避光操作。

28人工胃液和人工腸液中常山堿的穩定性研究

人工胃液的制備：取稀鹽酸164 mL加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪勻后加水定容至1 000 mL，即得。人工腸液的制備：取磷酸二氫鉀68 g，加水500 mL使溶解，用01 mol·L-1氫氧化鈉調節pH至68。取胰酶10 g，加水適量溶解；將兩液混合后加水稀釋至1 000 mL，即得。endprint

取常山堿樣品適量，精密稱定，分別加人工胃液和人工腸液溶解并定容，制成濃度分別為857，817 mg·L-1的人工胃液和常山堿人工腸液溶液。將上述2種溶液置于37 ℃水浴鍋內，分別在制備后第0，2，4，6，8，10 h取樣，HPLC檢測，測定放置不同時間后樣品溶液中常山堿的質量濃度。結果見表11，12。

由表11可見常山堿在人工胃液（pH 14）和人工腸液（pH 68）中都比較穩定，常溫放置10 h后常山堿較初始含量降低不足4%。表12顯示在人工胃液和人工腸液中常山堿的降解均不符合一級反應。

29常山堿固體的穩定性研究

291高溫試驗取常山堿樣品適量，置于敞口的棕色稱量瓶中放在藥物穩定性檢查儀（60 ℃）中，于第5天和第10天取樣，測定常山堿含量。

292高濕試驗取常山堿樣品適量，置于敞口的棕色稱量瓶中放在干燥器[底部放有NaCl飽和溶液，相對濕度為（75±1）%，25 ℃]里密閉保存，于第5天和第10天取樣，測定常山堿含量。

293強光照射試驗取常山堿樣品適量，置于敞口的透明稱量瓶中于澄明度檢測儀（3 000 lx）下照射，于第5天和第10天取樣，測定常山堿含量，見表13。

由表13可知高溫（60 ℃）對常山堿固體穩定性影響較小，在60 ℃下放置10 d常山堿含量幾乎無變化；高濕環境下，常山堿固體含量降低約7%，這除了有常山堿異構化為異常山堿的改變外還和固體吸濕導致含量降低有關；但是經強光照射10 d后，常山堿含量降低約5%，說明光照對常山堿固體有較大的影響。因此，常山堿固體應在避光、干燥環境下儲藏。

3討論

迄今為止，國內外學者已經對常山堿的分離純化、結構修飾和藥理活性進行了大量研究，但對其穩定性的研究卻很少。本文通過采用高效液相色譜測定相對含量的方法，比較了不同溶劑、不同pH水溶液、不同溫度和不同光照強度，以及人工胃液和人工腸液中常山堿的穩定性。結果表明，常山堿含量隨光照強度、溫度、溶液pH的升高而迅速下降。相對而言，常山堿在酸性和中性環境中較穩定。人工胃液和人工腸液里常山堿都比較穩定，因為前者為酸性而后者為中性，這和前期發現的規律相吻合。影響因素試驗是在比加速試驗更激烈的條件下進行，其目的是探討藥物的固有穩定性、了解影響其穩定性的因素及可能的降解途徑與降解產物，為制劑生產工藝、包裝、貯存條件和建立降解產物分析方法提供科學依據。本文依據2015年版《中國藥典》中影響因素試驗的要求，考察了常山堿固體在高溫（60 ℃）、高濕[（75±1）%]和強光（3 000 lx）條件下的穩定性，結果發現高溫下常山堿固體比較穩定，放置10 d后其含量基本沒有變化；高濕條件下雖然常山堿含量降低7%左右，除了因為常山堿異構化為異常山堿外還和樣品吸濕有關，還因為自制常山堿對照品較少因此并沒有測定高濕前后樣品中水分的含量，后續的實驗中將會驗證這一點；而在強光條件下，常山堿固體的外觀雖然沒有變化，但其含量明顯降低，說明光照對其穩定性有較大影響。以上結果提示常山堿的制備純化和相關制劑的生產都應該在酸性或中性溶液中、避光、低溫快速操作完成，而常山堿固體應在干燥、避光條件下保存。

絕大多數單體成分在制備純化和貯藏加工過程中都會受到各種因素的影響而降解，這些成分發生降解反應的動力學模型基本上符合零級或一級動力學反應模型。零級反應速度與反應物濃度無關，而受其他因素的影響，如反應物的溶解度或催化酶的濃度等，零級反應的半衰期與反應物起始濃度成正比。一級反應速率只與反應物濃度的一次方成正比，一級反應的半衰期與反應物起始濃度無關，是一個常數。本文測定了常山堿在不同條件下的化學動力學參數，結果發現其在常溫下的多種溶劑（水、不同濃度甲醇和乙腈溶劑）中、堿性溶液（pH 875）、不同光照強度及不同溫度（20，40 ℃）下的水溶液中的降解都基本符合化學動力學一級反應。但是溫度再升高（60，80 ℃）時的降解反應并不符合一級反應。而藥物的貯藏和制備通常在低溫（4 ℃）或常溫（25 ℃）下進行，因此今后的實驗中將考查常山堿在上述溫度下的化學動力學，若其符合一級反應，則可以應用動力學模型分別預測其在4，25 ℃下的半衰期及其架藏時間（含量降低10%的時間），相關結果將為常山堿類藥物的研發提供依據。

[參考文獻]

[1]中國藥典. 一部 [S]. 2015：313.

[2]Chou T Q， Fu F Y，Kao Y S. Antimalarial constituents of Chinese drug， Ch′ang Shan， Dichroa febrifuga Lour[J]. J Am Chem Soc，1948， 70：1765.

[3]Fu F Y， Jang C S. Chemotherapeutic studies on Ch′ang Shan， Dichroa febrifuga[J]. Sci Tech Chin，1948， 1：56.

[4]郭志廷，梁劍平，韋旭斌，等.常山提取物對人工感染雞柔嫩艾美耳球蟲病療效的觀察[J]. 中國獸醫學報，2013，33（7）：1083.

[5]Zhang H S，Huang C B.Effects of halofuginone contained in traditional Chinese herb of antifebrile dichroa root on wound healing and cicatrisation [J]. Chin J Clin Rehabil， 2003， 7（23）：3196.

[6]Deng Y H，Xu R S， Ye Y. A new quinazolone alkaloid from leaves of Dichroa febrifuga [J]. J Chin Pharm Sci，2000，9（3）：116.

[7]Maskan M. Production of pomegranate（Punica granatum L.） juice concentrate by various heating methods：colour degradation and kinetics[J]. J Food Eng， 2006， 72：218.

[責任編輯孔晶晶]endprint