釀酒酵母產泛酸工程菌株的構建與誘變

孫 杰，姜 杰，任 鄭，魏 春

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

釀酒酵母產泛酸工程菌株的構建與誘變

孫 杰，姜 杰，任 鄭，魏 春

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

泛酸具有重要的生理功能，參與糖、脂肪、蛋白質及能量的代謝，廣泛用作微生物藥物、食品添加劑和飼料添加劑.通過強化釀酒酵母泛酸生物合成途徑的酮泛解酸羥甲基轉移酶、酮泛解酸還原酶、泛酸合成酶和多胺氧化酶的表達水平，提高酵母泛酸合成量.在不含泛酸的培養基中培養102 h后，泛酸質量濃度達到290 μg/L.進一步對菌株BYPAN01進行微波輻照誘變，篩選到的突變株BYPAN02泛酸質量濃度較菌株BYPAN01和BY4741分別提高了43.3%和203.2%，達到415.7 μg/L，為實現泛酸的環保和低成本合成提供了新的思路.

釀酒酵母；泛酸；表達盒；微波輻射

泛酸(pantothenic acid)，又稱遍多酸或維生素B5，具有手性，只有D型泛酸具備生理活性.泛酸在生物體內同腺嘌呤、核糖核酸和磷酸等生物分子組成輔酶A.輔酶A為乙?；磻妮o酶，參與糖、脂肪、蛋白質及能量的代謝[1].泛酸廣泛用作微生物藥物、食品添加劑和飼料添加劑.動物不能合成泛酸，只能通過飲食獲得.在細菌和酵母中，纈氨酸合成的中間代謝物α-酮異戊酸由酮泛解酸羥甲基轉移酶、酮泛解酸還原酶和泛酸合成酶催化生成泛解酸[2-3].細菌中L-天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸，泛解酸和β-丙氨酸縮合生成泛酸[4].釀酒酵母的生長需要外源泛酸，而White等[3]發現酵母具有合成泛酸的能力，FMS1基因編碼的胺氧化酶催化精胺生成β-丙氨酸.當以葡萄糖為釀酒酵母的培養基碳源時，FMS1基因的表達受到抑制，酵母需要依靠外源泛酸維持生長；而當酵母以甘油或乙酸作為唯一碳源時，FMS1基因表達，酵母可以從頭合成泛酸[3].

在工業合成D-泛酸時，首先需要通過化學合成DL-泛解酸或泛解酸內酯，再進行手性拆分，工藝復雜，產物分離困難，并且需使用大量有機溶劑[5].飼料工業是泛酸的主要應用領域.酵母細胞含有大量蛋白質和豐富的維生素，廣泛應用于飼料工業[6].本研究目的是增強酵母的泛酸合成能力，從而提供一種簡單和低成本的泛酸來源.

1 材料與方法

1.1 菌種與質粒

S.cerevisiaeBY4741(MATa, his3△1, leu2△0, met15△0, ura3△0)和泛酸含量測試菌LactobacillusplantarumATCC 8014均購自American type culture collection(ATCC)；pYES2質粒購自Invitrigen公司.

1.2 試劑和引物

Prim star HS DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性內切酶NcoI和HindIII、T4 DNA連接酶、100 bp plus Marker、基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司.所用引物列于表1，引物名稱中同一個大寫字母表示一個表達盒.引物合成及測序由上海桑尼生物科技有限公司完成.

1.3 培養基

YPD培養基(1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖)用于酵母培養和感受態制備;缺少尿嘧啶的SD-Ura培養基購自北京泛基諾科技有限公司，用于重組子的篩選;無泛酸培養基購自青島海博生物技術有限公司.

1.4 方 法

1.4.1 酵母菌的培養

搖瓶培養時，平板上挑取單克隆，接種至5 mL的SD-Ura中培養過夜.培養物離心并用無菌水清洗后，加至50 mL的無泛酸培養基中，起始OD600 nm達到0.05，進行培養.

1.4.2 泛酸合成酵母菌的構建

按照Shao等[7]的方法進行質粒構建.為制備基因表達盒，首先提取釀酒酵母基因組DNA.使用表1列出的引物，用PCR分別擴增啟動子GPM1p(760 bp)，TDH3p(673 bp)，TEF1p(458 bp)和PGK1p(756 bp).分別將泛酸合成相關酶的編碼基因及其轉錄終止子ECM31(去除線粒體信號肽，1 018 bp)，PAN5(1 411 bp)，PAN6(1 256 bp)和FMS1(1 787 bp)擴增出來.PCR反應程序為98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃退火15 s，擴增啟動子延伸時間為1 min，擴增結構基因延伸時間為2 min，32 個循環.擴增pYES2的質粒骨架的PCR反應程序為98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃退火和延伸8 min，32 個循環.PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收DNA片段.

表1 用于構建基因表達盒的引物

使用重疊延伸PCR(OE-PCR)連接4個基因表達盒.首輪PCR反應體系不加入引物，以待連接片段互為引物和模板，反應程序為98 ℃變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，20個循環.取出5 μL作為模板，加入反應體系為50 μL的第二輪PCR反應中，使用表達盒外側引物，PCR程序為98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，68 ℃退火和延伸1.5 min，32 個循環.PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收DNA片段.

將上述4個基因表達盒(各300 ng)、線性的pYES2質粒骨架(500 ng)混合，使用乙酸鋰化學轉化法進行酵母細胞轉化.轉化后，涂布SC-Ura平板，30 ℃培養2～3 d后長出單菌落.將克隆隨機挑入液體培養基，培養1 d，然后提取質粒DNA，使用PCR進行陽性轉化子的驗證.表達質粒的菌株命名為BYPAN01.

1.4.3 微波誘變

為進一步提高菌株的泛酸產量，進行了酵母菌的微波誘變.使用無菌水將酵母懸液調整至107cells/mL，30 ℃下在SD-Ura培養基中進行培養.將培養物的試管插在冰中，微波輻射數秒.微波爐輸出功率850 W，2 450 MHz.輻射處理后，涂布SC-Ura平板培養，確認質粒沒有因突變而丟失.30 ℃培養2 d，計算致死率.致死率=(誘變前菌落數-誘變后菌落數)/誘變前菌落數×100%.

挑取突變后的50 個單菌落，30 ℃下在試管中液體培養2 d，取上清通過微生物法測定泛酸含量.選取泛酸產量較高的菌株進行下一輪誘變.連續進行5 輪誘變，最后一輪誘變得到的菌株培養于不含泛酸的培養基中，30 ℃培養至96 h.泛酸產量最高的突變株命名為BYPAN02.

1.4.4 微生物法測定泛酸含量

以L.plantarumATCC 8014作為測定菌株，在泛酸測定培養基中測定泛酸的含量[8].取100 μL酵母工程菌的發酵上清液于3 mL泛酸測定培養基中，121 ℃高壓滅菌15 min.接種50 μL植物乳桿菌，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，直至植物乳桿菌的光密度不再發生變化.同時使用0～60 ng泛酸標準品，制作泛酸含量與植物乳桿菌生長狀況的標準曲線.通過測定植物乳桿菌在640 nm的光密度，間接測定泛酸含量.

2 結果與討論

2.1 釀酒酵母泛酸合成基因的克隆與表達盒組裝

從酵母基因組中擴增了4個組成型啟動子和4個帶有終止子的泛酸合成基因(圖1a)，通過OE-PCR方法，在體外成功組裝了GPM1p-ECM31，TDH3p-PAN5，TEF1p-PAN6和PGK1p-FMS14個表達盒(圖1b).同時擴增pYES2質粒骨架.4個表達盒與質粒骨架之間有45 bp左右堿基互相重疊.

M—100 bp plus Marker；A1—GPM1p；A2—ECM31；B1—TDH3p；B2—PAN5；C1—TEF1p；C2—PAN6；D1—PGK1p；D2—FMS1；V—載體骨架(a) PCR獲得的核酸片段電泳圖

M—100 bp plus Marker；A—表達盒GPM1p-ECM31；B—表達盒TDH3p-PAN5；C—表達盒TEF1p-PAN6；D—表達盒PGK1p-FMS1(b) 表達盒的OE-PCR組裝產物電泳圖圖1 泛酸合成基因表達盒組裝過程中的DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis of the assemblied expression cassettes involving in pantothenic acid synthesis

2.2 增強釀酒酵母泛酸的合成

本實驗使用組成型強啟動子，過表達泛酸合成途徑的酮泛解酸羥甲基轉移酶、酮泛解酸還原酶和泛酸合成酶.另外，葡萄糖為唯一碳源時，FMS1基因的表達受到抑制，無法合成泛酸.而通過組成型啟動子增強FMS1基因表達，可以解除葡萄糖對酵母泛酸合成的抑制.而當培養基中同時含有乙酸鈉和葡萄糖兩種碳源，泛酸的合成則不會完全被葡萄糖抑制.如圖2所示，宿主菌BY4741在無泛酸平板劃線，酵母菌可以生長，但是生長并不旺盛.而通過基因改造得到的菌株BYPAN01在無泛酸平板劃線，菌株生長旺盛.說明高表達泛酸合成的相關酶，并解除葡萄糖對酵母泛酸合成的抑制后，泛酸可以在酵母體內合成.

A—菌株BYPAN01；B—菌株BY4741；C—菌株BYPAN02圖2 構建酵母菌的無泛酸平板劃線培養Fig.2 Culture of the engineered yeast on the agar plate with pantothenic acid-free medium

在不含泛酸的培養基中同時含有乙酸鈉和葡萄糖兩種碳源，泛酸的合成不會完全被葡萄糖抑制，原始菌株BY4741在不含泛酸的培養基中培養102 h后，泛酸質量濃度達到137.1 μg/L.相同培養時間，菌株BYPAN01的泛酸質量濃度達到290 μg/L.

2.3 誘變和篩選

微波誘變具有正突變頻率高和所選育菌株遺傳性狀穩定等優點[9].Grundler等[10]發現微波輻照對酵母細胞的生長具有較大影響.為進一步提高表達ECM31，PAN5，PAN6和FMS1基因的菌株的泛酸產量，進行了微波輻照誘變實驗.酵母致死率和輻射時間的關系見圖3.隨著輻射時間的延長，酵母的致死率升高.普遍認為酵母致死率達到85%左右，正向突變的概率最高.當微波照射時間為85 s，酵母致死率達到85.3%.每次誘變后，涂布SC-Ura平板，確認質粒沒有因突變而丟失.

圖3 酵母菌微波誘變致死曲線Fig.3 The lethal curve of yeast after microwave mutagenesis

5輪突變-篩選之后，選取平板上較大的單菌落接種于搖瓶中，在50 mL不含泛酸的培養基中30 ℃培養120 h，測定突變株的泛酸產量.通過微波輻照，篩選得到泛酸產量提高的突變株BYPAN02.如圖4(a)所示，泛酸產量提高的菌株，到達生長平臺期后的生物量較宿主菌略低.這可能與菌株BYPAN01帶有強啟動子驅動的ECM31，PAN5，PAN6和FMS1基因，造成較大的代謝負擔有關.如圖4(b)所示，在培養102 h后，突變株BYPAN02泛酸質量濃度較BYPAN01和BY4741菌株分別提高了43.3%和203.2%，達到415.7 μg/L.然而該產量仍然較低，下一步需要對中心代謝途徑進行改造，結合發酵培養優化，進一步提高泛酸產量.

圖4 不同酵母菌株的生長曲線和泛酸質量濃度Fig.4 Growth curve and pantothenic acid yield of different yeast strains

3 結 論

泛酸具有重要的生理功能，是重要的營養補充劑.筆者嘗試使用代謝工程改造的酵母合成泛酸.將帶有強啟動子驅動的泛酸合成相關基因ECM31，PAN5，PAN6和FMS1基因構建菌株BYPAN01.在不含泛酸的培養基中培養102 h后，泛酸質量濃度達到290 μg/L.進一步對菌株BYPAN01進行微波輻照誘變.篩選到的突變株BYPAN02泛酸質量濃度較BYPAN01和BY4741菌株分別提高了43.3%和203.2%，達到415.7 μg/L.然而該產量仍然較低，下一步需要對中心代謝途徑進行改造，結合發酵培養優化，進一步提高泛酸產量，才有可能具備應用價值.

[1] WILLIAMSON J M, BROWN G M. Purification and properties of L-Aspartate-alpha-decarboxylase, an enzyme that catalyzes the formation of beta-alanine inEscherichiacoli[J]. Journal of biological chemistry, 1979, 254(16):8074-8082.

[2] SCHMITZBERGER F, SMITH A G, ABELL C, et al. Comparative analysis of theEscherichiacoliketopantoate hydroxymethyltransferase crystal structure confirms that it is a member of the (βα)8 phosphoenolpyruvate/pyruvate superfamily[J]. Journal of bacteriol, 2003, 185:4163-4171.

[3] WHITE W H, GUNYUZLU P L, TOYN J H.Saccharomycescerevisiaeis capable of de novo pantothenic acid biosynthesis involving a novel pathway of beta-alanine production from spermine[J]. Journal of biological chemistry, 2001, 276(14):10794-10800.

[4] CRONAN J E. Beta-alanine synthesis inEscherichiacoli[J]. Journal of bacteriology, 1980, 141(3):1291-1297.

[5] 汪釗, 黃美娟, 高亮, 等.化學酶法合成D-泛解酸內酯的研究進展[J]. 發酵科技通訊, 2016, 45(4):193-198.

[6] 樓志堅, 戴利偉, 張艷麗. 固態發酵生產活性干酵母的研究[J]. 發酵科技通訊, 2016,45(2):98-102.

[7] SHAO Z, ZHAO H, ZHAO H. DNA assembler, aninvivogenetic method for rapid construction of biochemical pathways[J]. Nucleic acids research, 2009, 37(2):e16.

[8] 張旭, 馬妮, 鄭洪. 微生物法測定食品中泛酸的含量[J].中國微生態學雜志, 2012, 24(7):654-655.

[9] 李永泉, 翁醒華, 賀筱蓉. 微波誘變結合化學誘變選育酸性蛋白酶高產菌[J]. 微生物學報, 1999(4):181-184.

[10] GRUNDIER W, KEILMANN F. Resonant microwave effect on locally fixed yeast microcolonies[J]. Zeitschrift für naturforschung C, 1989, 44(9/10):863-866.

(責任編輯：朱小惠)

Construction and mutagenesis of engineeringSaccharomycescerevisiaestrain producing pantothenic acid

SUN Jie, JIANG Jie, REN Zheng, WEI Chun

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Pantothenic acid has important physiological functions involved in sugar, fat, protein and energy metabolism. As such, it was widely used as microbial drugs, as well as food and feed additives. To increase the yield of pantothenic acid, the expression of enzymes responsible for pantothenic acid synthesis inSaccharomycescerevisiae, such as ketopantoate hydroxymethyltransferase, 2-dehydropantoate-2-reductase, pantoate-beta-alanine ligase and polyamine oxidase were increased. The yield of pantothenic acid reached 290 μg/L after 102 h incubation in pantothenic acid-free medium. The strain BYPAN01 was further mutated by microwave irradiation and the obtained mutant BYPAN02 resulted in production of 415.7 μg/L pantothenic acid, which was 43.3% higher than that of BYPAN01 and 203.2% higher than that of wild type BY4741. This study provides a new strategy for the environment-friendly and low cost synthesis of pantothenic acid.

Saccharomycescerevisiae; pantothenic acid; expression cassettes; microwave irradiation

2017-06-02

浙江省自然科學基金資助項目(LQ14C010002)；浙江工業大學自然科學基金資助項目(1301105071408)

孫 杰(1981—)，男，內蒙古包頭人，講師，博士，研究方向為代謝工程，E-mail：jsun@zjut.edu.cn.

Q93

A

1674-2214(2017)03-0134-04