清熱活血方對II 型膠原誘導型關節炎大鼠相關指標的影響研究?

王海霞，曹 煒，張 聰，智 愷，武子英，劉立玲，果 彤，燕美彤(. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 0005； . 中國中醫科學院，北京 00700； . 北京中醫藥大學，北京 0009)

【實驗研究】

清熱活血方對II 型膠原誘導型關節炎大鼠相關指標的影響研究?

王海霞1，曹 煒2△，張 聰2，智 愷2，武子英1，劉立玲1，果 彤3，燕美彤3
(1. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053； 2. 中國中醫科學院，北京 100700； 3. 北京中醫藥大學，北京 100029)

目的： 觀察清熱活血方對II 型膠原誘導型關節炎大鼠血管內皮生長因子(vegf)、白細胞介素-6(IL-6)的影響，探討清熱活血方對類風濕關節炎滑膜血管新生的抑制機理。方法： 應用免疫組化技術檢測CD31在CIA大鼠膝關節滑膜組織中的表達，ELISA法檢測CIA大鼠血清中血管內皮生長因子和白細胞介素的表達，并觀察清熱活血方對其的影響。結果： 用免疫組化法檢測微血管數量發現，清熱活血方中、小劑量組與模型組比較微血管數量明顯減少，清熱活血方大劑量組與模型組比較微血管數量減少，差異有統計學意義。CIA大鼠血清vegf、IL-6檢測中，與模型組比較清熱活血方中、小劑量組vegf表達降低，清熱活血方中劑量組IL-6表達降低明顯。結論: 中小劑量的清熱活血方通過下調VEGF和IL-6的表達，可減少炎癥細胞對滑膜的浸潤，抑制血管新生，進而達到控制活動性RA病情的目的。

清熱活血；類風濕關節炎；血管內皮生長因子；白細胞介素-6

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要表現的全身性自身免疫病。本病表現為以雙手、腕、膝、踝、足關節等小關節受累為主的對稱性、持續性多關節炎。本實驗采用II型膠原誘導型關節炎模型觀察清熱活血方對CIA大鼠關節病理、免疫組化及血清指標的影響，以揭示清熱活血方對滑膜血管新生的作用機制。

1 材料

1．1 實驗動物

清潔級雌性SD大鼠70只，體質量(200±20) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格證編號SCXK(京) 2012-0001)。SD大鼠在實驗期間喂養于恒溫、恒濕環境，自由飲水，飼料固定。

1．2 試劑及儀器

免疫源性牛II 型膠原(貨號20021)、完全弗氏佐劑(貨號7001)均購自 Chondrex公司，清熱活血方由我院科研藥房提供，vegf ELISA試劑盒購自abcam公司(貨號ab100786)，IL-6 ELISA 試劑盒購自新博盛生物科技有限公司(貨號ERC003)，抗CD31抗體購自R&D公司(貨號AF3628)。

組織包埋機(型號HISTOSTAR)、石蠟切片機(型號RM2245)、切片染色機(型號ST5020)、手提式均質儀(型號IKA-T10 Basic Ultra-turrax)、熒光顯微鏡(型號BX50)、酶標儀(型號WellscanMK2)。

2 方法

2.1 清熱活血方的制備

清熱活血方組成：土茯苓30 g,金銀花30 g，炒蒼術15 g，黃柏9 g，赤芍15 g，萆薢15 g，丹參15 g，莪術9 g，青風藤15 g，生薏苡仁30 g，蜈蚣2條，蜂房5 g。按處方比例稱取飲片加水中火煮沸后，文火煎煮30 min過濾取藥汁，再加水按上述方法操作，將2次藥汁混合濃縮至濃度2 g(生藥)/mL。

2.2 動物分組及給藥

將雌性SD大鼠70只按隨機序列法分為正常對照組、CIA模型組、清熱活血方低、中、高組(15、20、25 g生藥/kg)、抑制劑ZD6474組(50 mg/kg)、MTX組(10 mg/kg)7組。自免疫第1天開始即給藥，中藥組按15、20、25 g生藥/kg、抑制劑ZD6474組(50 mg/kg)進行灌胃，正常對照組與模型組灌服2ml生理鹽水，每天1次，連續21 d。MTX組(10 mg/kg)灌胃每周2次，連續21 d。

2.3 CIA大鼠模型的建立

除正常對照組外，其余6組制備CIA模型。于大鼠尾根部皮下注射0.15ml膠原乳化劑，第7天加強免疫方法同前。正常組以等量生理鹽水對照處理。

2.4 關節腫脹度測定

采用排水法測量大鼠足體積，每周測 2 次，直至實驗結束。

2.5 細胞因子檢測

大鼠腹主動脈取血，冰上靜置2 h，2500 rpm離心15 min取血清，ELISA備用。

2.6 微血管密度測量

將大鼠滑膜組織放入10% 福爾馬林固定2 h，將已固定的標本取出，經梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后石蠟包埋?；の⒀苊芏?microvessel density，MVD)用1∶50稀釋的CD31抗體標記血管內皮細胞。在200倍顯微鏡下觀察滑膜微血管密度(microvessel density，MVD)，每張片選取3個血管集中視野拍照，并計數取均值。

2.7 關節病理

取雙后肢踝關節去除附著皮毛組織，浸泡在 10%多聚甲醛(福爾馬林)溶液中，隔天換液，5% 硝酸浸泡脫鈣2周，每周換液 2次，至刀片能輕松切斷骨質后重新浸泡至 10% 多聚甲醛溶液中，石蠟包埋、切片，HE染色。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 各組CIA大鼠關節腫脹度

圖1表1顯示，從首次免疫第10天開始，各組造模大鼠后肢關節出現不同程度的紅腫，隨時間推移關節腫大程度進一步加劇。與正常組比較，模型組大鼠關節腫脹明顯(P<0.01)；在第18天左右，ZD6474組、MTX組、中藥中、小劑量組大鼠關節腫大趨勢得到抑制(P<0.01)。

圖1 各組CIA大鼠關節腫大程度注：a. 正常組;b. 模型組；c. ZD6474組；d. MTX組；e.中藥大劑量組；f.中藥中劑量組；g.中藥小劑量組

3.2 各組CIA大鼠關節病理

圖2顯示，白色箭頭所示為骨關節面。關節病理可見，正常組關節面連續，骨小梁完整，未發現炎性細胞浸潤；與正常組比較，模型組骨關節面中斷、消失，骨小梁與近關節面骨端破壞，大量炎性細胞浸潤。中藥大劑量組與小劑量組骨關節缺損較多，并有大量炎性細胞浸潤。其余3組雖有較多炎性細胞浸潤，但骨關節面尚存，偶有不連續，近關節面骨端基本完整。

圖2 各組CIA大鼠關節的破壞程度(HE 12.5×)注：a.正常組;b.模型組；c. ZD6474組；d. MTX組；e.中藥大劑量組；f.中藥中劑量組；g.中藥小劑量組

3.3 各組CIA大鼠滑膜微血管密度和血清中VEGF、IL-6的表達水平

圖3表1顯示， CD31是分子量為 130KD的跨膜糖蛋白, 在血管內皮細胞的連接處表達水平較高。本實驗用其定位血管內皮細胞，圖3中淺色標記為陽性血管。與正常組比較，模型組血管數量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，ZD6474組、MTX組、中藥中劑量組、中藥小劑量組微血管數量均顯著減少(P<0.01)，中藥大劑量組微血管數量也明顯減少(P<0.05)。

圖3 各組CIA大鼠滑膜微血管密度(MVD)(IHC-P 200×)注：a 正常組;b 模型組；c ZD6474組；d MTX組；e中藥大劑量組；f中藥中劑量組；g中藥小劑量組

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清VEGF與IL-6表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，MTX組、中藥中劑量組大鼠血清中IL-6表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，ZD6474組、MTX組、中藥中小劑量組大鼠血清中VEGF表達水平明顯降低(P<0.05)。

4 討論

RA在中醫文獻中被稱為歷節、鶴膝風、頑痹、尪痹等，屬于中醫“痹癥”范疇，其發病以正虛為本、外感為標，并與患者體質、飲食及生活習慣等息息相關。臨床觀察發現，RA患者以濕熱證多見，或外感濕熱之邪，或風寒濕郁久化熱， 或恣食肥甘厚味，濕熱內生。濕熱內蘊，煉液為痰，壅滯血脈，氣血輸注不利，瘀血內生，不能榮養四末筋骨，故見關節紅腫疼痛、屈伸不利甚至關節畸形[1]。在RA活動期應用清熱活血方，可起到清熱活血、調節免疫的作用。

表1 各組CIA大鼠相關指標

注：與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

RA發病首先侵犯關節滑膜，導致炎性細胞浸潤和滑膜血管增生。增生的滑膜需要更多的血供以滿足其對氧氣和營養物質的需求，因而血管新生在血管翳形成和維持方面起關鍵性作用。

IL-6是由2條糖蛋白鏈組成的多肽，是參與機體免疫應答和免疫調節的重要細胞因子。RA患者的T細胞、B細胞等都可產生IL-6，IL-6誘導肝細胞合成多種急性時相蛋白，這些蛋白促進B細胞產生類風濕因子及多種免疫球蛋白使RA炎癥加劇[2]。RA患者滑膜中IL-6、血清中slL-6R與慢性滑膜炎及關節損害程度呈正相關。將RA患者滑液中分離的成纖維細胞進行培養，IL-6及其sIL-6R共同作用可以提高VEGF水平，抗IL-6受體抗體可以降低VEGF水平[3]。另外，在RA患者中，血清IL-6的水平與C反應蛋白水平相關。IL-6的過表達可以使骨質吸收加速，形成減少[4]。VEGF是一種細胞來源廣泛的多功能性糖蛋白，可促進內皮細胞遷移、增殖，在RA血管新生方面有重要作用[5-6]。VEGF 在RA中是聯系各種炎性因子的樞紐，可直接促進滑膜血管新生并增加血管通透性。

本實驗選取IL-6、VEGF和CD31作為觀測RA炎癥與血管新生的指標。實驗結果顯示，清熱活血方可以明顯減輕大鼠關節的腫脹程度。關節病理顯示，清熱活血方可抑制滑膜細胞的增殖，延緩或抑制骨破壞。ZD6474已證明，在抑制血管新生方面效果顯著[7-9]，屬于陽性藥。最近有文獻報道，MTX在抑制血管新生方面亦具有明顯效果[10]。大鼠MVD測定中，模型組血管數量明顯增多,清熱活血方中劑量組、小劑量組對血管新生的抑制作用較為顯著，清熱活血方大劑量組對血管新生的抑制作用也較為明顯。在細胞因子檢測中，模型組大鼠血清中VEGF、IL-6表達量顯著高于正常組,清熱活血方中劑量組、MTX組大鼠血清中二者的表達量明顯低于模型組，與模型組比較大鼠血清VEGF的表達水平也明顯降低。而清熱活血方大劑量組對血清VEGF、IL-6的作用不明顯。綜合來看，清熱活血方中劑量組無論是在抑制炎癥還是在抑制血管新生方面均較明顯，小劑量組次之。

綜上，中小劑量的清熱活血方能夠下調VEGF和IL-6的表達，減少炎癥細胞對類風濕關節炎滑膜的浸潤，抑制血管新生，從而達到控制活動期RA病情的目的。

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國家自然科學基金面上項目(81373592)-基于血管新生miR-125b-PIGF/Flt1信號傳導通路探討清熱活血法治療活動期類風濕關節炎的分子免疫機制

王海霞(1988-)，女，河南人，醫學碩士，從事類風濕關節炎的基礎與臨床研究。

△通訊作者：曹 煒，女，主任醫師，醫學博士，碩士研究生導師，從事類風濕關節炎的基礎與臨床研究，Tel:13601331063,E-mail:caowei6636@126.com。

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1006-3250(2017)08-1071-03

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