大粒型水稻材料千粒質量的QTL檢測

汪欲鵬+武志峰+歐陽鴻飛+王智權+譚雪明+石慶華+潘曉華 吳自明

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.012[HT9.]

摘要：為挖掘控制水稻千粒質量的數量性狀位點（QTL），同時為水稻超高產育種提供重要的育種材料，利用大粒型水稻材料lg1與常規秈稻品種9311構建的F2代遺傳分離群體，采用完備區間作圖法（ICIM），以LOD值2.5為閥值，對水稻千粒質量QTLs進行檢測、分析。結果表明，F2代群體中千粒質量性狀呈連續變異的單峰分布，為多基因控制的數量性狀；共檢測到千粒質量QTLs 5個，分布于第2、5、9號染色體上，LOD值介于2.65～11.77之間，表型貢獻率變異范圍為4.62%～52.78%，其中表型貢獻率大于10%的主效QTLs共有3個；除[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]等位基因來源于9311外，其余4個QTLs增效等位基因均來自大粒材料lg1。定位的QTLs所在區間均有相關QTLs或基因被報道，是否為等位基因則需進一步試驗驗證。研究結果為大粒材料lg1千粒質量QTLs的精細定位及其在水稻超高產育種中的應用奠定了基礎。

關鍵詞：水稻；大粒型；千粒質量；數量性狀位點（QTL）

中圖分類號： S511.03文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0046-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-05-20

基金項目：江西省科技支撐計劃（編號：20121BBF60009、20132BBF60004）；國家自然科學基金（編號：31560350）。

作者簡介：汪欲鵬（1990—），男，江西贛州人，博士研究生，主要從事作物生理與遺傳育種研究。E-mail：wypkj23@163.com。

通信作者：吳自明，博士，教授，主要從事作物生理與遺傳育種研究。E-mail：wuzmjxau@163.com。

[ZK）]

水稻是世界上重要的糧食作物，其產量的提高對解決糧食安全問題具有重要的推動作用。千粒質量性狀與水稻產量息息相關，同時也是重要的品質性狀，它主要通過控制谷粒的大小及灌漿程度，最終影響水稻的產量[1-3]。隨著耕作方式和水肥管理措施的日益改進，通過增加單位面積有效穗數的方法已很難實現水稻產量的大幅度提高，而增加穗質量有利于水稻進一步增產[4]。改善水稻千粒質量是增加穗質量的主要途徑之一，有研究表明，千粒質量每提高1 g，產量可增加400 kg/hm2[5]。另外，通過分子標記輔助選擇技術，將控制水稻千粒質量數量性狀位點（QTL）或基因導入水稻品種，進而改善水稻千粒質量，是提高水稻千粒質量的重要方法[6-7]。因此，挖掘控制水稻千粒質量的QTLs或基因對水稻產量的增加具有重要意義。

水稻千粒質量主要受谷粒大小、灌漿程度的影響，在遺傳上一般表現為多基因控制的數量性狀，而構建定位群體的雙親之間千粒質量存在極顯著差異是進行千粒質量相關QTL定位的重要前提。張亞東等利用特大粒粳稻材料TD70（千粒質量達80 g）和常規秈稻品種Kasalath雜交、多代自交構建的重組自交系群體，定位得到一系列與谷粒大小相關的QTLs，同時也發現了[WTBX][STBX]qGT2.2、qGW9、qGT9[WTBZ][STBZ]可能的新QTLs[8]。張強等利用極端大粒材料SGL156（千粒質量71.90 g）和特小粒材料川7雜交、回交獲得的BC2F2群體，檢測到28個與谷粒大小相關的QTLs，并發現了一系列可能的新QTLs[9]。孫濱等利用秈稻品種BG1（千粒質量達57.65 g）和粳稻小粒品種XLJ雜交建立的重組自交系群體，共檢測到34個粒型、粒質量相關的QTLs，同時也定位到了一些可能的新的QTLs[10]。此外，已經克隆或精細定位的與千粒質量相關的基因[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][11]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]qGL3.1[WTBZ][STBZ][13]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][14]和[WTBX][STBX]GL2[WTBZ][STBZ][15]等均發現于大粒型水稻材料。因此，大粒型水稻材料是挖掘新的粒型、粒質量QTLs或基因的理想材料。

本研究利用發現于常規秈稻品種96-6種植田間的特大粒材料lg1（千粒質量47.58 g）與常規秈稻品種9311雜交、自交構建的F2代遺傳分離群體，采用完備區間作圖法，對其控制千粒質量的QTLs進行檢測和分析，以期為新的千粒質量QTL位點的精細定位和克隆奠定基礎，同時也為大粒材料lg1在超高產育種中的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

大粒型材料lg1是來源于常規秈稻品種96-6種植田間發現的特大粒材料，經多年種植確認其大粒性狀可以穩定遺傳。利用秈稻品種9311與大粒材料lg1配制F2代分離遺傳群體，用于千粒質量性狀的QTL檢測。大粒材料lg1、9311及F2代群體均種植于江西農業大學科技園，所有材料采用小區種植，60株/小區，株行距約20 cm×20 cm，正常水肥管理。

1.2千粒質量性狀的測定

在成熟期，除去邊株，分別隨機收取lg1、9311各10株，F2代群體213株單株用于千粒質量性狀分析。千粒質量利用萬深SC-G自動考種儀進行測定，具體為每個單株取300粒左右飽滿種子稱質量，換算為千粒質量，即為該單株的千粒質量，其中lg1、9311測定10個單株，取平均值，作為該材料的千粒質量。

1.3PCR擴增及電泳分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[16]（略有改進）提取水稻分蘗期葉片DNA，-20 ℃保存。PCR擴增采用 10 μL 體系：1 μL 10×buffer，0.2 μL dNTP Mix（各 2 mmol/L），2 μL引物（F、R各 2 μmol/L），0.1 μL rTaq酶，1 μL DNA模板，ddH2O補足至 10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個循環；72 ℃ 2 min。PCR產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，電泳結果經0.1%硝酸銀染色，蒸餾水洗滌，1.5% NaOH溶液顯色后，觀察帶形。endprint

1.4連鎖圖譜的構建及千粒質量的QTL檢測

利用大粒材料lg1、9311對筆者所在實驗室保存的512對SSR標記、Indel標記進行多態性篩選，將獲得的多態性標記對F2代群體中213個單株進行基因型分析，其中帶形與lg1相同的記為2，與9311相同的記為0，雜合型記為1。利用QTL IciMapping 4.0軟件中MAP功能進行遺傳連鎖圖譜構建，采用軟件bip功能中的完備區間加顯性模型（ICIM-ADD），以LOD值2.5為閥值，掃描步長1.0 cM，在全基因組范圍進行千粒質量性狀QTL檢測，QTL的命名遵循McCouch的原則[17]。

[BT1+*8]2結果與分析

[HTK]2.1大粒型材料lg1與9311千粒質量性狀分析[HT]

由圖1、表1可知，大粒型lg1的穗型、粒型均要顯著大于9311，是優質的大粒型水稻材料。此外，通過測定可知，lg1千粒質量約為47.58 g，比9311大60.26%，兩者之間存在極顯著差異，適合構建群體，進行千粒質量性狀QTL的定位。

2.2F2代群體千粒質量性狀分析

由圖2可知，F2代群體中，千粒質量性狀呈連續變異的單峰分布，這表明F2代群體中千粒質量性狀是由多主效基因控制的數量性狀；各單株千粒質量變化范圍為29.49～46.74 g，平均值約為37.18 g，偏度、峰度均在-1.51～0.27之間，接近正態分布，說明獲得的表型數據適合用于進一步的QTL檢測分析。

[FK（W10][TPWYP2.tif][FK）]

2.3F2代群體單株基因型鑒定及遺傳連鎖圖譜的構建

利用大粒lg1、9311對512對SSR、Indel標記進行篩選，共獲得95對差異明顯的多態性標記，多態率為18.55%。利用獲得的95對多態性標記對F2代遺傳分離群體中213個分離單株進行基因型鑒定，與lg1帶形相同的單株基因型記為2，與9311帶形相同的單株基因型記為0，雜合型單株記為1。將各單株的基因型值輸入Map文件中，采用QTL IciMapping 4.0軟件中的MAP功能進行連鎖圖譜的構建。結果表明，構建的圖譜覆蓋水稻基因組約2 196.67 cM，標記間平均距離為23.12 cM，每條染色體上的標記數為7.92個。

2.4千粒質量性狀QTL檢測結果分析

由表2、圖3可知，本研究共檢測到千粒質量QTLs 5個，分布于第2、5、9號染色體上，LOD值介于2.65～11.77之間，表型貢獻率變異范圍為4.62%～52.78%，其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]貢獻率分布分別達到了 52.78%、21.78%、17.73%，是3個控制千粒質量性狀的主效QTLs。其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]加性效應為負值，增效等位基因來源于9311，檢測到的其他4個QTLs加性效應均為正值，增效等位基因均來源于大粒材料lg1。

3結論與討論

千粒質量是水稻產量性狀的重要組成部分，定位和克隆與千粒質量相關的基因一直是水稻研究的熱點領域。截至目前，已有[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][9]、[WTBX][STBX]TGW6[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][10]、[WTBX][STBX]GW5[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]GS5[WTBZ][STBZ][20]、[WTBX][STBX]GW8[WTBZ][STBZ][21]、[WTBX][STBX]GW6A[WTBZ][STBZ][22]等與千粒質量相關的基因被克隆，利用千粒質量相關的基因或QTLs開發分子標記，應用于品種改良中對水稻增產具有重要的現實意義。本研究利用大粒型水稻材

[FL）][FK（W18][TPWYP3.tif][FK）]

[FL（2K2]料lg1與9311構建F2代遺傳分離群體，群體中千粒質量性狀呈連續變異的單峰分布，同時，定位到5個與千粒質量相關的QTLs，表型貢獻率介于4.62%～52.78%之間，說明千粒質量性狀是由多個微效基因、主效基因控制的數量性狀。定位到[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]表型貢獻率均大于17.73%，是3個主效的千粒質量QTLs。對這些QTLs進一步進行驗證，表現穩定的QTLs可用于開發分子標記，應用于育種研究中。此外，[WTBX][STBX]qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]加性效應為正值，增效等位基因來源于大粒材料lg1，是控制其千粒質量的主效QTLs。

與前人的研究對比發現，本研究定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]所在區間RM7451～RM71已有千粒質量相關基因[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ]被克隆，該基因編碼1個環形E3泛素連接酶，將底物錨定至蛋白酶體上進行降解，進而負調控谷粒細胞分裂[10]。另外，張亞東等也在此區間內定位到了[WTBX][STBX]qGW2-1、qGW2-2、qGT2-1、qGL2-1和qGT2-3[WTBZ][STBZ]等與粒型相關的QTLs[8]。定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-2[WTBZ][STBZ]所在標記區間RM71～RM13069也是千粒質量QTL定位的熱點區域，張強等在此區間內定位到[WTBX][STBX]qTGW2-1、qRLW2-1和qGT2-1[WTBZ][STBZ]等與千粒質量相關的QTLs[9]；孫濱等也定位到千粒質量QTL [WTBX][STBX]qTGW2[WTBZ][STBZ]、粒寬QTL [WTBX][STBX]qGW2-1[WTBZ][STBZ]和粒厚QTL [WTBX][STBX]qGT2-2[WTBZ][STBZ][10]。[WTBX][STBX]qTGW-2-3[WTBZ][STBZ]定位區間RM13174～RM3763大小為79.86 cM，此區間內有大量與千粒質量相關的QTLs被報道[6，8，23-24]，同時已經克隆的[WTBX][STBX]GS2也在此區間內，GS2[WTBZ][STBZ]等位基因在miR396靶點發生1個稀有的顯性突變，造成該基因表達顯著上升，促進了細胞的分裂和生長，最終特異地增加了穗長、籽粒大小[12]。而關于[WTBX][STBX]qTGW-2-3是否與GS2等位，有待于進一步試驗驗證。qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]在RM17962～RM169標記區間內，已經克隆的千粒質量相關基因[WTBX][STBX]GW5在此區間內，GW5[WTBZ][STBZ]編碼1個核定位蛋白，該基因的功能缺失后泛素不能轉移到靶蛋白上，使得底物不能被特異識別和降解，從而激活了穎花外殼細胞的分裂，進而穎花外殼的寬度增加，最終谷殼的寬度、粒質量及產量都得到了提高[17]，[WTBX][STBX]qTGW-5-1定位的區間較小，推測GW5[WTBZ][STBZ]很可能是等位基因。檢測到[WTBX][STBX]qTGW-9-1[WTBZ][STBZ]所在標記區間為RM3808～RM3249，Xie等在此區間內已經精細定位了粒寬基因[WTBX][STBX]GW9.1[WTBZ][STBZ][25]，孫濱等在該區間內定位到了[WTBX][STBX]qTGW9、qGT9、qGW9[WTBZ][STBZ][10]，[WTBX][STBX]qTGW-9-1所在區間較小，該位點很可能與GW9.1[WTBZ][STBZ]等位。endprint

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