生物炭和豬糞堆肥對Cd污染土壤上黑麥草生理生化的影響

楊園 王艮梅 曹莉 項衛東 陳容

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.054[HT9.]

摘要：通過室內盆栽試驗，研究添加不同物料（生物炭和豬糞堆肥）對不同Cd2+濃度（0、5、10、20、40 mg/kg）污染下黑麥草（Perennial ryegrass）生長2個月后體內Cd濃度、光合色素（葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、類胡蘿卜素）含量、抗氧化酶[過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）]活性，以及丙二醛（MDA）含量的影響。結果顯示：與CK相比，PM和BC處理顯著降低了黑麥草對Cd的吸收，但添加物料的2個處理之間（PM、BC）差異未達到顯著性水平。隨著外源Cd濃度的增加，光合色素含量呈降低的趨勢，PM、BC處理有助于提高黑麥草葉片光合色素含量。低Cd濃度（0、5、10 mg/kg）時，CK處理的黑麥草體內CAT、SOD活性較高，而高Cd濃度（20、40 mg/kg）時，PM和BC處理的黑麥草體內CAT、SOD活性對應高于CK處理。隨著Cd濃度的增加，MDA的濃度呈逐漸增加的趨勢，但PM和BC處理的黑麥草體內MDA濃度都低于CK處理，5 mg/kg的Cd濃度時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內MDA含量分別少30.39%和14.20%；Cd濃度為40 mg/kg時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內MDA含量分別少16.11%和26.64%。本研究結果表明，豬糞堆肥和生物炭均可降低黑麥草對Cd的吸收，低濃度Cd污染土壤采用豬糞堆肥緩解Cd對黑麥草的氧化脅迫效果較好，而高濃度Cd污染土壤添加生物炭緩解Cd對黑麥草的氧化脅迫效果更好。

關鍵詞：生物炭和豬糞堆肥；Cd污染土壤；黑麥草；光合色素；抗氧化酶

中圖分類號： X53文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0196-05[HS）][HT9.SS]

[HJ1.4mm]

收稿日期：2017-03-22

基金項目：國家自然科學基金（編號：31200472）；江蘇省科技支撐計劃重點項目（編號：BE2013357）。

作者簡介：楊園（1994—），女，漢族，碩士研究生，主要從事土壤環境污染化學方面的研究。E-mail：1092158915@qq.com。

通信作者：王艮梅，副教授，博士，主要從事土壤環境污染化學方面的研究。E-mail：wangyinmei519@163.com。[HJ]

[ZK）]

近年來，重金屬Cd成為我國土壤重金屬污染的首要污染物[1]，且采礦區周邊污染尤其嚴重[2]，Cd污染的濃度可達12.25～119.14 mg/kg，重金屬Cd的修復任務有待攻堅克難。Cd在生物體中具有高蓄積性及高毒性，所以被認為是最具生物毒性的重金屬污染物，在污染的土壤上種植植物有助于將土壤中的污染物轉移至植物體內[3]。黑麥草作為北方草坪建植常用的草坪草，具有生物量大、根系發達、生命力強的特點。此外，受到一定濃度的Cd脅迫時，植株體內的抗氧化酶活性提高[4]，其重金屬Cd修復潛力有待于進一步開發。

有機物料和生物炭常被用作土壤改良劑改良土壤肥力，改變某些污染物在土壤中的存在形態[5-6]。但由于改良劑的不同，修復土壤的類型及修復條件的不同，改良效果也存在差異。眾多研究表明，生物炭可以增加土壤肥力，提高土壤pH值，增大陰陽離子交換量，減少養分損失，減少污染土壤上有效態重金屬含量，有利于植物生長[7-9]。但也有研究表明，生物炭的生產工藝不同，對土壤重金屬形態的改變存在差異[10]，并且不同生物炭其作用效果也有差異[11]，此外，生物炭還有可能影響土壤N自由基含量[12]，生物炭對植物生理生化響應的影響尚無一致定論。王曉維等研究表明，生物炭可減輕Cu2+對油菜的毒害作用[5]。關于有機物料的研究結論也存在差異性，董同喜等研究表明，畜禽糞便有機肥可改變土壤中重金屬存在形態，降低重金屬對植物的毒害[13]，但Schrder等研究表明，當重金屬和有機外源性物質同時存在時會影響谷胱甘肽的作用，不利于植物對污染土壤的解毒[14]。目前，關于生物炭和堆肥的研究越來越多，有助于將廢物資源化和發展綠色經濟，而目前有關大豆秸稈為原材料的熱解生物炭作為重金屬Cd污染土壤吸附劑使用時，對Cd污染土壤上植物體生理生化影響的研究相對較少。此外，豬糞堆肥對不同Cd污染土壤上生長的黑麥草生理生化影響的研究較少。葉綠素含量和抗氧化物保護酶活性，可以作為評價植物在脅迫環境中自身抗性以及耐受性的指標，但不同的改良劑以及不同的Cd濃度條件下，植物體內的抗氧化酶活性也不一樣。因此，本試驗以黑麥草為對象，研究在不同Cd濃度污染土壤上，施用生物炭和豬糞堆肥后其體內抗氧化物保護酶活性和葉綠素含量的差異，以期為生物炭和豬糞堆肥在Cd污染土壤上施用后種植黑麥草進行植物修復的可行性分析提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1供試材料

黑麥草種子購自明達種子經營部，品種為牧大師（Graze master）；供試土壤為采自南京林業大學北大山表層（0～20 cm）的黏壤土，取回后在室內自然風干，剔除植物枯枝落葉和根系，過2 mm篩后保存備用；供試生物炭是大豆秸稈經400 ℃燒制而成；豬糞堆肥在江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所由豬糞及少量秸稈堆制而成。供試土壤及有機物料的基本理化性質見表1。[FL）]

1.2盆栽試驗設計

試驗設2個物料因素，分別為添加豬糞堆肥（PM）和生物炭（BC），同時設不添加物料的對照處理（CK），2個因素下及對照處理分別設5個不同的Cd濃度水平（分別為0、5、10、20、40 mg/kg），共計為15個處理，每個處理設3個重復，共45個盆缽。

試驗于2016年7月20日在南京林業大學溫室中進行，采用內徑15 cm、高20 cm統一規格的無洞花盆，每盆裝3 kg土，以N ∶[KG-*3]P ∶[KG-*3]K=180 ∶[KG-*3]100 ∶[KG-*3]150（mg/kg）的比例施入底肥（N由尿素提供，P由磷酸二氫鉀提供，K由磷酸二氫鉀和硫酸鉀提供）。生物炭和豬糞堆肥以土壤干質量2%的比例加入盆缽中并混勻。此外，在每個盆缽中插入底端包裹紗布并加入石英砂的直徑1 cm的PVC管，增加透氣性。將CdCl2配成對應的濃度梯度，以溶液的形式澆入土壤中，攪拌均勻，并保證土壤濕度為田間持水量的60%，平衡1周后播種黑麥草種子（2016年7月28日），播種前從盆中取出適量土壤，將200粒黑麥草種子整齊排列在盆缽中，并用之前取出的土壤均勻覆蓋黑麥草種子，種子表面覆蓋土壤的厚度約0.5 cm。黑麥草生長期間用稱質量法進行水分管理，生長2個月后采集地上部分，測定黑麥草葉片的光合色素含量，同時采集整個植株測定植物中Cd含量以及抗氧化酶活性。endprint

1.3分析項目及測定方法

葉綠素含量的測定采用乙醇浸泡法[15]；抗氧化物保護酶活性的測定參照孔祥生的植物生理學試驗技術[16]；超氧化物歧化酶（SOD）測定采用氮藍四唑法；過氧化物酶活性（POD）的測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外吸收法；丙二醛（MDA）的測定采用硫代巴比妥酸法；植株中Cd的含量采用硝酸-雙氧水消解，原子吸收分光光度計測定。

1.4數據統計

利用Microsoft Office 2010 進行數據整理與作圖，用SPSS 19進行方差分析。

2結果與分析

2.1黑麥草對土壤中Cd的吸收

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草體內Cd含量見圖1。由圖1可知，隨著土壤中Cd濃度的增加，所有處理黑麥草體內的Cd濃度也都呈增加趨勢。添加5、10、20、40 mg/kg Cd濃度后，3種處理黑麥草體內Cd含量分別是對應處理不添加Cd的6.43、8、12.33、23.22倍（CK），4.43、7.5、12.2、19.45倍（PM）和4、7.03、12.11、19.37倍（BC）?？梢钥闯?，有機物料的添加對黑麥草對Cd的吸收有明顯的影響。添加生物炭和豬糞堆肥后黑麥草體內Cd含量都較不添加物料的對照有明顯下降趨勢。當Cd濃度為0 mg/kg時，CK、PM、BC處理黑麥草體內Cd含量無顯著性差異；當Cd濃度為5 mg/kg時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內Cd含量分別顯著降低33.14%、37.83%；當Cd濃度為10 mg/kg時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內Cd含量顯著降低；當Cd濃度為20 mg/kg時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內Cd含量有降低的趨勢，但未達到顯著性水平；當Cd濃度為 40 mg/kg 時，PM、BC處理較CK處理黑麥草體內Cd含量分別顯著降低19.11%、16.11%。在各個濃度下，PM和BC處理之間有一定的差異，但未達到顯著性水平。

[FK（W13][TPYY1.tif][FK）]

2.2黑麥草葉片中光合色素含量

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草葉片光合色素含量見圖2。由圖2可知，黑麥草葉片中葉綠素a含量最多，其次是葉綠素b，最后是類胡蘿卜素。隨著外源添加Cd濃度的增加，葉綠素含量呈降低趨勢，類胡蘿卜素沒有顯著變化。添加豬糞堆肥和生物炭有助于提高光合色素含量?？梢钥闯?，各處理葉綠素a含量隨著外源Cd濃度的增加呈下降的趨勢。Cd濃度為40 mg/kg時，CK、PM、BC處理的葉綠素a含量較其對應的不添加Cd處理分別顯著降低2667%、22.22%、15.79%。相同Cd濃度下的不同物料處理，當土壤不添加外源Cd時，BC和PM處理葉綠素a含量顯著高于CK處理，BC和PM處理間無顯著性差異；Cd濃度為 5 mg/kg 和10 mg/kg時，葉綠素a含量大小為PM>BC>CK，差異均達到顯著性水平；Cd濃度為20 mg/kg和40 mg/kg時，黑麥草葉綠素a含量為BC>PM>CK（圖2-a）。葉綠素b濃度見圖2-b，各處理葉綠素b含量隨著Cd濃度增加總體呈先增加后降低的趨勢，且PM、BC處理的葉綠素b含量高于CK處理。添加不同物料，總葉綠素含量與不同Cd濃度的關系如圖2-c所示，總葉綠素含量在較低Cd濃度時有些許的上升，但總體是隨著Cd濃度的增加呈下降的趨勢。土壤不添加外源Cd時，PM和BC處理類胡蘿卜素含量顯著高于CK處理，較CK處理顯著提高66.67%和83.33%；當Cd濃度為5 mg/kg時，3個處理間無顯著性差異；當Cd濃度為10 mg/kg時，PM處理較CK處理增加60%，達到顯著性水平，BC處理較CK處理增加20%，未達到顯著性水平；Cd濃度為 20 mg/kg 和40 mg/kg時，黑麥草葉片類胡蘿卜素含量大小為BC>PM>CK（圖2-d）。[FL）]

[FK（W22][TPYY2.tif][FK）]

[FL（2K2]2.3黑麥草體內過氧化氫酶活性

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草體內過氧化氫酶（CAT）活性見圖3。由圖3可知，黑麥草葉片的CAT活性隨著外源Cd濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，Cd濃度為0 mg/kg和5 mg/kg時，CK處理CAT活性最高，當Cd濃度大于10 mg/kg時，PM和BC處理的CAT活性高于CK處理。與不添加外源Cd相比，CK、PM、BC處理CAT活性分別提高33.9%、37.98%、26.33%（Cd濃度為5 mg/kg），38.61%、43.21%、61.40%（Cd濃度為10 mg/kg），差異均達到顯著性水平，且Cd濃度為10 mg/kg，CK處理CAT活性達到最大值，為86.67 U/（g·min）；Cd濃度為20 mg/kg和 40 mg/kg 時，CK處理較不添加外源Cd的處理顯著降低1129%和18.76%，PM、BC處理CAT活性較不添加外源Cd的處理分別顯著增加79.05%、44.12%和60%、38.60%?？梢钥闯?，當Cd濃度為5 mg/kg和10 mg/kg時，CK、PM、BC3個處理間無顯著性差異；當Cd濃度為20 mg/kg和40 mg/kg時，3種處理間黑麥草葉片CAT活性為PM>BC>CK，且差異均達到顯著性水平，20 mg/kg Cd處理時，PM、BC較CK分別高80.76%、41.34%；40 mg/kg Cd濃度處理，PM、BC較CK分別高76.38%、48.43%。

2.4黑麥草超氧化物歧化酶活性

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草體內超氧化物歧化酶（SOD）活性見圖4。由圖4可知，PM和BC處[CM（25]理下的SOD活性隨Cd濃度的升高呈先增大后降低的趨[CM）]

[FK（W11][TPYY3.tif][FK）]endprint

勢，較低Cd濃度（5 mg/kg和10 mg/kg）時，CK處理SOD活性最高；較高Cd濃度（20 mg/kg和40 mg/kg）時，BC處理SOD活性最高。當Cd濃度為10 mg/kg時，CK與PM處理SOD活性均達到最大值，分別為505.47 U/g和469.65 U/g，較不添加外源Cd處理SOD活性（分別為382.09 U/g和31443 U/g）分別提高了32.29%和49.37%，之后隨著Cd濃度的增加黑麥草葉片SOD活性呈下降的趨勢；當Cd濃度為20 mg/kg時，BC處理SOD活性達到最大值（525.37 U/g），較不添加外源Cd的處理SOD活性（394.03 U/g）提高了3333%，差異顯著，之后隨著Cd的增加SOD活性呈下降的趨勢。相同Cd濃度下的不同物料處理，不添加外源Cd時，PM處理較CK處理顯著低了17.71%，BC處理與CK處理無顯著性差異；Cd濃度為5 mg/kg時，不同處理間的SOD活性大小為CK>PM>BC，PM和BC分別比CK低3.99%和1000%；Cd濃度為20 mg/kg時，PM處理較CK處理SOD活性顯著低13.86%，而BC處理則較CK處理高30.69%。

2.5黑麥草體內過氧化物酶活性

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草體內過氧化物酶（POD）活性見圖5。由圖5可知，不同處理POD變化規律存在一定的差異性，CK處理的黑麥草POD活性隨著Cd濃度的增加呈先增加后降低趨勢；PM處理黑麥草POD活性在Cd濃度≤20 mg/kg時，變化不是特別顯著，當Cd濃度為40 mg/kg時，黑麥草POD活性顯著提高；BC處理Cd濃度為5 mg/kg時較不加外源Cd處理顯著性增加，之后隨著Cd濃度的增加，無顯著性差異?？傮w看來，添加生物炭處理的黑麥草POD活性高于PM及CK處理（除Cd濃度為 40 mg/kg 時）。PM處理在Cd濃度為40 mg/kg時，POD活性較不加外源Cd的處理高59.06%，差異達到顯著性水平；BC處理在Cd濃度5 mg/kg時，POD活性較不添加外源Cd的處理高39.29%，差異顯著，之后隨著Cd濃度的增加，黑麥草POD活性一直處于較高水平。不同物料添加對POD活性影響不同。當不添加外源Cd時，黑麥草POD活性大小為BC>PM>CK處理，且差異均達到顯著性水平；Cd濃度為5 mg/kg和20 mg/kg時，BC處理的黑麥草POD活性顯著高于PM處理和CK處理，但PM處理和CK處理間無顯著性差異；Cd濃度為40 mg/kg時，BC和PM處理黑麥草POD活性顯著高于CK處理，分別高31.08%和36.49%。

2.6黑麥草體內丙二醛含量

不同Cd濃度污染土壤上添加有機物料后，黑麥草體內丙二醛（MDA）含量見圖6。由圖6可知，隨著Cd濃度的增加，MDA的含量逐漸增加，且CK處理黑麥草MDA含量一直顯著高于BC和PM處理。Cd濃度為5 mg/kg及10 mg/kg時，與不添加外源Cd的對照處理相比，3種處理MDA含量增加的幅度都較??；Cd濃度為20 mg/kg和40 mg/kg時，CK、PM、BC分別是對應不添加外源Cd的1.68、1.98、1.66倍和1.84、2.04、1.67倍，差異均達到顯著性水平。相同Cd濃度下的不同物料處理，CK處理的黑麥草體內MDA含量高于BC和PM處理，且差異均達到顯著性水平，但PM和BC差異未達到顯著性水平（Cd濃度為0 mg/kg和10 mg/kg時）。Cd濃度為5 mg/kg時，與PM相比，BC處理MDA含量高23.26%，差異達到顯著性水平。Cd濃度為20 mg/kg和 40 mg/kg 時，PM、BC處理的黑麥草MDA含量較CK分別低10.74%、20.29%和16.11%、26.64%，差異均顯著。[FL）]

[FK（W11][TPYY4.tif；S+2mm][FK）]

[FL（2K2]

3討論

隨著Cd濃度的升高，黑麥草體內重金屬富集濃度也增加，土壤中添加豬糞堆肥和生物炭降低了黑麥草體內的Cd含量，這可能是由于豬糞堆肥及生物炭的添加提高了土壤pH值，降低了土壤中重金屬的有效性，減少了土壤中重金屬向植物體中的轉移。生物炭由于具有較高的pH值，微孔結構以及高陽離子交換量，所以可以固化土壤中的重金屬，降低重金屬的生物毒性；豬糞堆肥增加土壤中結合態胡敏酸的含量，緩解土壤的酸化，提高土壤pH值并提高土壤養分，有助于降低土壤中可提取態的重金屬Cd，提高植物穩定化，這與Nawab等的研究結論[17]類似。

Cd進入植物體內，作用于植物光合作用有關的細胞器，影響植物光合作用[18]。本研究中，隨著Cd濃度的增加，光合色素含量的確有下降的趨勢。在不添加外源Cd時，PM處理和BC處理的葉綠素a含量要高于CK處理，這可能是因為施加物料增加了土壤中的養分，提高了黑麥草光合作用的能力；其他Cd濃度下，添加物料的處理黑麥草葉綠素a含量也高于不加物料處理，一方面豬糞堆肥和生物炭的加入提高了土壤pH值，降低了土壤中有效態的Cd，從而減少了重金屬對植物的毒害作用，另一方面豬糞堆肥和生物炭為植物提供了更多的養分需求。葉綠素b含量在Cd濃度為5 mg/kg時有略微上升趨勢，之后隨著Cd濃度的增加，逐漸下降，這可能是因為植物細胞在低濃度的Cd濃度下，植物體內的應答機制不僅會保護植物還可能促進植物葉綠素b含量的增加。此外，盡管光合色素含量之間有一定的差異，但大部分差異未達到顯著性水平，這可能是由于黑麥草自身對Cd的抗性，試驗設置的Cd濃度梯度未達到使得黑麥草光合色素含量顯著降低的閾值，這也可能由于Cd脅迫下，PSⅡ啟動光保護機制，減輕了脅迫對光合作用器官的傷害[4]。

重金屬Cd是植物生長的非必需元素，植物在一定濃度的Cd污染土壤上生長，會受到與鹽脅迫或干旱脅迫[19]類似的重金屬脅迫，產生脅迫應答反應，提高植物體內的抗氧化酶活性，抗氧化酶活性是評價植物抗逆性以及植物在逆境中忍受能力強弱的指標。研究結果表明，不添加物料與添加豬糞堆肥和生物炭處理，CAT和SOD的活性隨著Cd濃度的增加總體上呈先增大后降低的趨勢，這可能是由于受到Cd脅迫，黑麥草細胞內的自由基含量增多，植物會出現質膜損傷效應，為了緩解這種毒害作用，細胞內的抗氧化物保護酶活性增強，但隨著Cd濃度的增加，對細胞的損傷作用不斷加強，可能損害合成這些抗氧化物保護酶的有關蛋白質和基因。豬糞堆肥處理和生物炭處理黑麥草CAT和SOD活性出現降低趨勢時的Cd濃度要高于不加物料處理，這可能是由于物料的加入減少了植物對重金屬的吸收，另一方面也可能物料的加入增加了植物的抗性能力。POD活性的變化沒有一致規律，存在一定的波動性，這與Solti等的研究[20]一致，因為POD在不同的階段其主要作用的亞型不同，發揮的功能也不一樣。但CK處理，總體上POD的活性也是隨著Cd濃度的增加呈現先增大后降低的趨勢，豬糞堆肥和生物炭處理，隨著Cd濃度的升高POD的活性增大，有助于清除植物體的 O-2[KG-*2]· [KG-*3]。黑麥草可以通過提高體內抗氧化酶活性來增強對Cd的抗性，并且添加生物炭及豬糞堆肥在一定Cd濃度范圍內可以緩解Cd對黑麥草的毒害作用，黑麥草通過提高抗氧化酶活性平衡體內產生的活性氧自由基。endprint

MDA是判斷植物受到氧化脅迫程度的重要指標[21]，隨著Cd濃度的增加，植物體吸收的Cd含量增加，對植物細胞的迫害程度加大，所以MDA濃度增加。但添加豬糞堆肥及生物炭處理可以緩解Cd對植物的毒害程度，一方面物料的添加降低了土壤中可溶態的重金屬，另一方面有機物料添加保證了高濃度污染土壤上抗氧化物酶活性，緩解了活性氧對植物的毒害作用。此外，外源添加Cd濃度為5 mg/kg和 10 mg/kg 時，PM處理黑麥草的氧化脅迫程度最低；外源添加Cd濃度為20 mg/kg和40 mg/kg時，BC處理的氧化脅迫程度最低。

4結論

黑麥草對重金屬Cd表現出超強的耐性，能夠在Cd污染土壤上生長并吸收土壤中的重金屬Cd。隨著Cd濃度的增加，黑麥草體內的抗氧化物保護酶活性也上升，但超過一定濃度時，抗氧化酶又有降低的趨勢。

添加生物炭和豬糞堆肥會固化土壤中的重金屬，減少黑麥草對重金屬的吸收，從而增加黑麥草在重金屬污染土壤上生長的耐性和抗性。并且，土壤中Cd濃度為5 mg/kg和 10 mg/kg 時，添加豬糞堆肥植物受到氧化脅迫較低且植物體內Cd含量高于添加生物炭；當土壤Cd濃度為20 mg/kg和40 mg/kg時，添加生物炭處理植株受到的氧化脅迫較其他處理更低，且黑麥草體內Cd含量高于添加豬糞堆肥處理，但添加生物炭和豬糞堆肥后，黑麥草對重金屬的吸收差異未達到顯著水平。

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