牡丹籽酶解制備降血糖肽工藝的響應面優化

顏輝　蔡豪　賈俊強

摘要：為開發一種新型降血糖肽，以牡丹籽蛋白為原料，探索使用生物酶法制備牡丹籽降血糖肽。以α-葡萄糖苷酶抑制活性為標準，使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶進行最佳酶類篩選，選擇抑制活性最好的酶，然后使用單因素試驗、響應面試驗優化工藝條件。胰蛋白酶的抑制效果最好，響應面優化得到最優工藝條件：蛋白濃度為08%、加酶量為5 401.57 U/g、溫度為37.62 ℃、時間為43.18 min、pH值=8.07。該條件下經過試驗驗證α-葡萄糖苷酶的實際抑制率達到22.21%，與預測值22.11%基本吻合，模型回歸顯著。該結論為牡丹籽降血糖肽進一步研究與生產提供基礎，也為牡丹籽蛋白高效利用提供新方向。

關鍵詞：牡丹籽蛋白；α-葡萄糖苷酶抑制率；酶解；響應面法；最優工藝條件

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0167-04

牡丹油是我國新型的食用油，其中牡丹籽的含油率為29%[1]，粗蛋白含量約占20%，蛋白含量較為豐富。牡丹油營養價值高，需求量也越來越大。迄今為止，油料牡丹的種植面積已達2萬hm2以上[2]。榨油后的牡丹籽粕多作為飼料，深層次的加工利用較少，如何高效利用牡丹籽蛋白是本領域亟待解決的問題[3]。

糖尿病是一種嚴重影響人們身體健康的疾病[4]。近年來，隨著經濟飛速發展，人們的飲食越來越好，運動卻日趨減少，糖尿病的發病率逐年增加。傳統的降血糖藥分為葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、胰島素促分泌劑、中成藥、胰島素、雙胍類、磺酞脲類等7種藥物類型[5-7]，由于藥物治療存在副作用，長期使用患者難以接受。近年來，通過食療達到控制血糖的方法越來越受到人們的青睞，其中新開發的α-葡萄糖苷酶抑制物是專家學者的努力方向。

最新研究表明，蛋白質經過蛋白酶酶解之后所獲得的生物活性物質多肽具有降血壓、降血脂等功效[8]，雜色蛤、蠶絲、蛋清、乳清等蛋白經過酶解也表現出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以起到輔助降血糖作用[9-14]。以牡丹籽蛋白為酶解底物、酶解多肽對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為評價指標，建立制備方法，并采用響應面法進行工藝優化，獲得最佳酶解參數，為開發新型降血糖多肽提供試驗依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

試驗動物為昆明小鼠，購自江蘇大學試驗動物中心（合格證編號：20152299）。

試驗材料與藥品：牡丹籽購自安徽省亳州市譙城區萬畝藥材種植農民專業合作社；對硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷（pNPG）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；胰蛋白酶（質量比1 ∶250）、木瓜蛋白酶均購自國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶購自北京奧博星生物技術有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1牡丹籽蛋白的制備

牡丹籽經65 ℃烘干12 h，剝殼，65 ℃烘干8 h，榨油，將所得牡丹籽粕烘干粉碎，與蒸餾水按照料液比1 g ∶[KG-*3]10 mL混溶，1 mol/L NaOH調節pH值至 9.5，50 ℃超聲水浴2 h，3 800 r/min離心15 min；所得沉淀重復提2次，合并所得溶液，4 mol/L鹽酸調節pH值至4.5，4 000 r/min 離心15 min，棄上清；將所得沉淀55 ℃烘干，粉碎，過40目篩得到牡丹籽蛋白。

1.2.2α-葡萄糖苷酶制備

脫臼處死小鼠，取小腸浸泡于0 ℃生理鹽水中，洗去雜物，液氮研磨。將研磨粉與pH值=6.8的0.05 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）質量體積比1 mg ∶10 mL加入，渦旋振蕩 30～60 s，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.3檢測方法

酪氨酸標準曲線與酶活力的測定方法參照周景祥等的方法[15]；α-葡萄糖苷酶抑制率測定方法參照Lee等的方法[14]。

1.2.4單因素條件的篩選與響應面試驗設計

以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標，通過單因素試驗對加酶量、底物濃度、溫度、時間、pH值等條件進行篩選。根據單因素試驗結果，將加酶量、溫度、時間、pH值作為響應面設計的響應值進行分析。

1.2.5數據分析

通過Design Expert 8.0.6軟件建立響應面模型與分析數據。

2結果與分析

2.1酶類篩選的結果

分別選取豬胰蛋白酶、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行蛋白酶的篩選試驗。反應體系為50 mL，時間為 3 h，底物濃度為2%，按照各自適宜pH值、溫度進行反應。酶解反應容器放在恒溫水浴鍋內，間歇攪拌，加入1 mol/L NaOH溶液維持pH值穩定。反應結束后，沸水浴10 min滅酶，冷卻之后8 000 r/min離心10 min，取上清液檢測α-葡萄糖苷酶抑制率。

由表1可知，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解多肽產物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較差，胰蛋白酶酶解產物抑制效果較好。這可能是因為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶切位點較為廣泛導致產物多樣，胰蛋白酶酶切位點較為特殊，酶切位點集中在精氨酸（arginine，簡稱Arg）、賴氨酸（lysine，簡稱Lys）為羧基端的肽鍵部分[16]，特殊序列能對α-葡萄糖苷酶分子產生抑制作用。因此，選擇胰蛋白酶進行試驗。

2.2單因素試驗結果

2.2.1不同酶解時間對抑制率的影響

在不同時間點0、10、20、30、40、50、60、70 min，加酶量為5 000 U/g，底物濃度為0.8%，溫度為37 ℃，pH值=8.0的條件下分別檢測抑制效果。由圖1可知，在0～40 min時抑制率不斷上升，可能是因為胰蛋白酶將牡丹籽蛋白質切成具有抑制活性的多肽不斷增多，在40 min時抑制率達到最高，繼續延長反應時間，抑制率并未有明顯增加，因此選擇40 min作為最優時間。

2.2.2不同加酶量對抑制率的影響

在加酶量為0、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，時間為40 min，底物濃度為 0.8%，溫度為37 ℃，pH值=8.0的條件下分別檢測抑制效果。由圖2可知，加酶量在0～6 000 U/g范圍內，α-葡萄糖苷酶抑制率隨著加酶量增加明顯增強，當超過 5 000 U/g 之后增幅平緩，這可能是酶分子結合位點達到飽和，反應速度增加緩慢。因此，選擇5 000 U/g的加酶量作為最適加酶量。

2.2.3不同底物濃度對抑制率的影響

在底物濃度為0、02%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%，加酶量為 5 000 U/g，時間為40 min，溫度為37 ℃，pH值=8.0條件下分別檢測抑制效果。由圖3可知，底物濃度在0～0.8%內，隨著底物的逐漸增多，抑制率明顯上升，在0.8%～3.0%內，抑制率上升緩慢，一方面可能是蛋白中存在一定的蛋白酶抑制劑[17]，一方面酶分子達到飽和。為了更加經濟，選擇0.8%濃度進行響應面設計。

2.2.4不同pH值對抑制率的影響

在pH值為6、7、8、9、10，加酶量為5 000 U/g，時間為40 min，溫度為37 ℃，底物濃度為0.8%時，分別檢測抑制效果。由圖4可知，在6～10的范圍內，隨著pH值的增加，α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現先上升后下降的趨勢；在pH值為8.0時達到最大值；pH值在 8～10范圍內，抑制率下降。這表明胰蛋白酶的最適pH值為8.0，因此選擇8.0作為最優pH值。

2.2.5不同溫度對抑制率的影響

在溫度為31、34、37、40、43 ℃，加酶量為5 000 U/g，時間為40 min，底物濃度為 0.8%，pH值為8.0時分別檢測抑制效果。由圖5可知，在溫度31～37 ℃范圍內，隨著溫度升高，抑制率逐漸增高，對于 α-葡萄糖苷酶的抑制率呈快速上升趨勢，37 ℃時達到頂點，然后在37～43 ℃時緩慢下降，表明胰蛋白酶的最適溫度為37 ℃，因此選擇 37 ℃ 作為最優溫度。

2.3響應面優化試驗

2.3.1響應面試驗設計與結果

為優化酶解工藝，在單因素試驗的基礎上，采用二次回歸旋轉組合設計，對酶解工藝進行優化試驗，選取加酶量（A）、溫度（B）、時間（C）、pH值（D）作為4個因素， 每個因素選取5個顯著水平結合前期單因素結果，設定各因素水平編碼（表2），響應面設計與結果如表3所示。

2.3.2模型方差分析

在蛋白質酶解的工藝參數中，影響抑制效果的因素按照主次順序排列：A（加酶量）>B（溫度）>C（時間）>D（pH值）。加酶量和溫度有顯著差異，時間和pH值無差異顯著性；加酶量與溫度、pH值存在交互作用，達到顯著水平。

模型極其顯著，失擬項不顯著；總決定系數R2=0958 5，調整決定系數R2=0.896 3，說明該模型的擬合程度較好，該方程模型成立，可以進行預測（表4）。

抑制率=21.7+1.49A+1.23B+0.61C-0.52D-1.5AB-0.6AC+1.72AD+0.76CD-1.74A2-2.09B2-0.85C2-2.09D2。

在分析回歸模型結果的基礎上，根據上述二次方程，作酶解加酶量、溫度、時間、pH值對抑制率影響的響應面圖，分析2個因素交互作用的影響[18]。由圖6-a可知，沿酶解加酶量方向等高線比溫度方向等高線密集，說明加酶量對抑制率的影響要大于酶解溫度的影響；由圖6-b可知，沿加酶量等高線比時間等高線密集，說明加酶量對抑制率的影響大于時間的影響；由圖6-c可知，沿pH值等高線遠遠比加酶量等高線密集，說明pH值對抑制率的影響高于加酶量；由圖6-d可知，沿pH值的等高線密度比時間因素等高線密集，說明pH值對抑制率的影響高于時間。

在底物濃度為0.8%的條件下，經過響應曲面分析得出酶解牡丹籽蛋白最優工藝條件：加酶量為5 401.57 U/g，溫度為37.62 ℃，時間為43.18 min，pH值為8.07，此條件預測抑制率達到22.11%。為驗證模型可靠性，進行3次驗證，測得抑制率為22.21%，與預測值基本一致?？梢?，得到的優化工藝參數準確可靠，具有實用性。

3結論

牡丹籽蛋白是一種新型的蛋白，作為傳統飼料利用價值較低。本研究選用牡丹籽蛋白，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，通過單因素篩選和響應面試驗得出最優酶解工藝：蛋白濃度為0.8%、加酶量為5 401.57 U/g、溫度為37.62 ℃、時間為43.18 min、pH值為8.07，抑制率達到22.11%，經過驗證試驗抑制率為22.21%，因此模型可靠，回歸顯著，具有應用價值。本試驗為酶法制備牡丹籽降血糖肽的進一步研究提供基礎，也為牡丹籽蛋白的高效利用指引一條新的道路。

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