大豆低溫誘導啟動子GmERF9P的克隆及活性鑒定

翟 瑩，張 軍，任巍巍，張 闖，趙 艷，張梅娟

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

大豆低溫誘導啟動子GmERF9P的克隆及活性鑒定

翟 瑩1，張 軍2，任巍巍1，張 闖1，趙 艷1，張梅娟1

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

為獲得低溫誘導基因GmERF9啟動子，并分析該啟動子的功能，利用PCR技術從大豆葉片基因組DNA中克隆1 885 bp的GmERF9啟動子序列GmERF9P。序列分析表明，GmERF9P序列中含有多種與逆境相關的順式作用元件。將GmERF9P構建到植物表達載體pCAMBIA1301上并轉化煙草。通過PCR檢測共獲得6株T1陽性轉基因煙草株系。對野生型煙草和轉基因煙草進行低溫處理2 h，通過GUS組織化學染色和實時熒光定量PCR檢測GUS基因的表達量。結果顯示GmERF9P在低溫處理下能夠提高GUS基因的表達量，具有低溫誘導啟動活性。

大豆；GmERF9P；啟動子；低溫誘導；轉基因煙草

啟動子是DNA分子上位于結構基因上游，具有多種順式作用元件的一段DNA序列，能夠結合RNA多聚酶從而啟動結構基因的轉錄[1]。內源或外源基因的表達效率主要取決于啟動子的活性。按照基因的表達方式，植物基因啟動子可以分為組成型啟動子、組織特異型啟動子及誘導型啟動子[2]。組成型啟動子雖然能夠有效地驅動外源抗逆基因過量表達，但這種無組織、無環境、無時間特異性的表達不僅會造成植物營養和能源的浪費，甚至會引起植物生理代謝紊亂，進而影響植物的正常生長發育。例如應用CaMV35S啟動子改良植物抗逆性時，引起了植株的矮化畸形[3-4]。而逆境脅迫誘導啟動子在正常環境下不影響植物的正常生長代謝，只在植物遭受不良環境時啟動抗逆基因的超量表達，使植物表現出一定的抗逆性。因此，特定條件下的植物遺傳改良才是未來植物基因工程的研究方向。

目前，國內外存在一些有關低溫誘導啟動子的報道。例如擬南芥rd29A啟動子是目前抗寒基因工程中應用最廣泛的誘導型啟動子，由rd29A驅動DREB1A基因在煙草中表達可以提高轉基因煙草對低溫的抗性，并且不會影響植株的正常生長[5]。分別將CaMV35S組成型啟動子和冷誘導rd29A啟動子驅動的CBF基因在轉基因煙草中表達，發現在低溫環境下由rd29A驅動CBF的轉基因植株比由CaMV35S驅動CBF的轉基因植株表型要正常[5]。擬南芥低溫誘導cor15a啟動子在馬鈴薯中也同樣具有低溫誘導表達的能力，暗示不同植物的低溫反應可能具有相同或相似的遺傳調控機制[6-7]。這些都為植物低溫誘導啟動子的克隆及應用提供了理論依據。

由于ERF類轉錄因子在植物應對逆境環境時起重要的調控作用[8-9]，ERF基因的研究也越來越受到人們的關注。但是目前大部分研究仍停留在基因的功能和調控等方面，對其抗逆分子機制研究仍然欠缺，尤其是ERF啟動子的相關研究很少。2013年于曉惠等[10]克隆了巴西橡膠的HbERF3啟動子，但并未做功能驗證。齊齊哈爾大學植物分子育種實驗室在2014年克隆大豆的GmERF5啟動子序列并進行了初步的活性分析，發現其具有干旱和低溫誘導啟動活性，但也未在植物中進行穩定表達驗證[11]。本實驗室在前期研究工作中證實大豆GmERF9基因在低溫(4 ℃)處理下表達量升高，且在處理2 h時表達量升高最顯著[12]。本研究克隆GmERF9基因的啟動子序列，與GUS基因融合構建植物表達載體并轉化煙草，進而鑒定該啟動子在低溫誘導下的啟動活性，為其在植物抗寒基因工程育種中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1試驗材料

試驗中所用大豆品種合豐46、煙草NC89、植物表達載體pCAMBIA1301、大腸桿菌DH5α菌株及根癌農桿菌EHA105菌株均由本實驗室保存。所用引物的合成及測序工作均由上海生工公司完成。

1.2啟動子克隆及序列分析

將已克隆的大豆乙烯響應因子基因GmERF9的cDNA序列于大豆基因組數據庫GmGDB(http：//www.plantgdb.org/GmGDB/)中進行Blast搜索，獲得其上游大概2 000 bp 的啟動子序列。利用引物設計軟件Primer 5設計該啟動子序列引物(F：5′-ACGCGTCGACCCGTGCAACTTGATATTCGT-3′，下劃線代表SalⅠ酶切位點；R：5′-GGCCATGGTTTTTGG

TTGTGAAATTGAGG-3′，下劃線代表NcoⅠ酶切位點)。采用植物基因組DNA提取試劑盒(購自北京鼎國生物技術公司)提取大豆葉片基因組DNA。以基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR 程序：94 ℃ 8 min ；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環；72 ℃ 延伸8 min。將上述擴增片段回收后與克隆載體pMD18-T(購自TaKaRa公司)連接并測序。利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)數據庫對啟動子中的順式作用元件進行預測分析。

1.3植物表達載體構建

用SalⅠ和NcoⅠ2種限制性內切酶(各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司)雙酶切pMD18-T-GmERF9P質粒，將酶切產物經瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(購自北京鼎國生物技術公司)純化后，與同樣用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切的pCAMBIA1301載體(目的為切除CaMV35S啟動子)連接，連接產物經熱激法轉化大腸桿菌DH5α。菌液擴繁后經質粒提取試劑盒(購自北京鼎國生物技術公司)提取質粒。質粒經SalⅠ和NcoⅠ雙酶切驗證后轉化根癌農桿菌EHA105。

1.4煙草轉化及篩選

利用農桿菌侵染煙草葉盤法將pCAMBIA1301-GmERF9P重組載體轉化煙草NC89[13]，同時轉化pCAMBIA1301空載體作為陽性對照。經潮霉素(8 mg/L)篩選，獲得T0抗性轉化苗。提取抗性轉化苗葉片DNA作為模板，提取野生型煙草葉片DNA作為陰性對照模板，以pCAMBIA1301-GmERF9P質粒作為陽性對照模板，進行PCR擴增，篩選T0陽性轉基因植株。單株收獲T0陽性轉基因植株的種子，將其在MS培養基(含潮霉素6 mg/L)中繼續篩選，獲得T1轉基因植株。對T1轉基因植株再次進行PCR檢測(方法同上)，取T1陽性轉基因煙草植株進行功能鑒定。

1.5GUS組織化學染色

將6周T1轉基因煙草置于4 ℃培養箱中進行低溫處理。剪取未處理的T1轉基因煙草葉片和低溫處理2 h的T1轉基因煙草葉片，同時剪取未處理和低溫處理2 h的野生型煙草葉片作為陰性對照，進行GUS組織化學染色：加入GUS染色液，于37 ℃溫育過夜，用75%的乙醇脫色至底色完全消失[14]。

1.6實時熒光定量PCR分析

將6周T1轉基因煙草置于4 ℃培養箱中低溫處理2 h。剪取低溫處理2 h和未處理的T1轉基因煙草葉片0.1 g，同時剪取pCAMBIA1301 T1轉基因煙草葉片作為陽性對照，迅速置于液氮中，-80 ℃保存備用。提取煙草葉片總RNA并反轉錄成cDNA第一鏈(試劑盒均購自北京鼎國生物技術公司)。以cDNA作為模板，選取煙草組成型表達基因α-tubulin(GenBank登錄號：AB052822)作為內參基因(F：5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′；R：5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′)，在BIO-RAD CFX96 Real-time PCR儀上進行實時熒光定量PCR。GUS基因擴增引物如下，F：5′-GATCGCGAAAACTGTGGAAT-3′；R：5′-TAATGAGTGACCGCATCGAA-3′[15]。反應體系參照Zhai等[12]進行，各處理均做3次重復，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1GmERF9P克隆及序列分析

經PCR擴增得到GmERF9 基因啟動子序列，命名為GmERF9P，長度1 885 bp(圖1)。將GmERF9P序列在NCBI數據庫中進行同源性Blast，沒有得到與其具有較高同源性的啟動子序列，表明GmERF9P是一個新的啟動子序列。利用在線數據庫PlantCARE和PLACE對GmERF9P進行序列分析，結果顯示(圖2)，GmERF9P序列中含有4個可能賦予GmERF9基因高轉錄水平的5′ UTR Py-rich stretch元件，2個水

楊酸響應元件TCA-element，3個防御與脅迫響應元件TC-rich repeats，1個厭氧誘導元件ARE、10個MYB轉錄因子結合位點、4個MYC轉錄因子結合位點和4個WRKY轉錄因子結合位點。以上結果表明GmERF9P可能對逆境脅迫存在響應。

M.DL2000 Marker；1.GmERF9P PCR擴增產物。

圖2 GmERF9P序列

2.2植物表達載體構建

通過SalⅠ和NcoⅠ 2個限制性內切酶位點，將GmERF9P構建到植物表達載體pCAMBIA1301上，替換pCAMBIA1301載體上GUS基因上游的CaMV35S啟動子。經質粒雙酶切，獲得與目的基因大小相同的酶切條帶(圖3)，表明目的基因已整合進植物表達載體。將含有目的基因的重組載體轉化根癌農桿菌EHA105。

M.DL2000 Marker；1～2.GmERF9P質粒雙酶切產物。M.DL2000 Marker；1-2.Products of GmERF9P plasmid double digestion.

2.3煙草遺傳轉化及轉基因植株篩選

取無菌煙草葉片進行遺傳轉化，在愈傷組織中篩選抗性芽，待抗性芽生長至1 cm左右時(圖4-A)，將其分離并轉到生根培養基中。4～5周后抗性芽長出根系并逐漸成苗(圖4-B)。經PCR檢測(圖5)，GmERF9P序列成功整合到煙草基因組中，共獲得GmERF9P陽性轉基因煙草6株。

圖4 GmERF9P轉基因煙草篩選

M.DL2000 Marker；1～6.GmERF9P轉基因煙草；7.野生型煙草；8.pCAMBIA1301-GmERF9P陽性質粒。M.DL2000 Marker；1-6.Transgenic tobacco of GmERF9P；7. Wild typetobacco；8. Positive plasmid of pCAMBIA1301-GmERF9P.

2.4GmERF9P的低溫誘導啟動活性分析

前期研究表明，低溫處理可使GmERF9表達量升高，且處理2 h效果最明顯。所以對GmERF9P轉基因煙草低溫處理2 h并進行GUS組織化學染色和實時熒光定量PCR分析。首先，煙草葉片的GUS組織化學染色結果如圖6所示，未處理和低溫處理2 h的野生型煙草葉片沒有被染成藍色；未處理的T1轉基因煙草葉片被染成藍色，但著色較淺，表明GmERF9P具有啟動子的啟動活性；低溫處理2 h的T1轉基因煙草葉片被染成藍色且著色較深，表明GmERF9P的啟動活性在低溫處理2 h時被誘導，使下游報告基因GUS的表達量增高。

A.未處理野生型煙草葉片；B.低溫處理2 h野生型煙草葉片；C.未處理T1轉基因煙草片；D.低溫處理2 h T1轉基因煙草片。A.Leaves of untreatment wild type tobacco；B.Leaves of wild type tobacco under cold treatment for 2 h；C.Leaves of untreatment T1 transgenic tobacco；D.Leaves of T1 transgenic tobacco under cold treatment for 2 h.

另外，GUS基因實時熒光定量PCR結果如圖7所示，在正常條件下GmERF9P轉基因煙草中GUS基因的表達量較低，低溫處理2 h時GmERF9P轉基因煙草中GUS基因的表達量明顯升高，再次證明GmERF9P具有低溫誘導啟動活性。

圖7 低溫處理 2 h轉基因煙草中GUS基因表達量Fig.7 The expression of GUS in GmERF9P transgenic tobacco under cold treatment for 2 h

3 討論

本研究采用生物信息學和PCR方法對大豆ERF轉錄因子GmERF9基因5′端調控區進行了克隆，得到了1 885 bp的GmERF9基因啟動子序列。對該序列進行在線軟件預測分析，結果顯示，該序列含有多種脅迫相關的順式作用元件。例如MYB元件在擬南芥抗逆相關基因rd22、rd17和rd19啟動子中均存在[1，16]；擬南芥中受低溫誘導表達的CBF1、CBF2和CBF3基因啟動子中均含有MYC元件[17]；旋蒴苣苔BhGolS1基因啟動子中含有4個WRKY元件與WRKY基因一起參與植物的脫水脅迫[18]。表明MYB、MYC和WRKY轉錄因子可能調節GmERF9基因的表達[19]。根據以上預測結果推測，GmERF9P可能與逆境脅迫誘導相關，具有逆境誘導啟動活性，當然還需進一步的試驗驗證。此推論與大豆中GmERF9基因在高鹽、干旱和低溫處理下表達量升高的結果相吻合[12]，這些表達量的升高可能與GmERF9P序列中存在響應逆境脅迫的順式作用元件相關。以往研究也表明，ERF家族基因廣泛參與植物的多種逆境應答。例如，玉米ZmERF1的表達可以被高鹽、高溫和滲透脅迫共同誘導[20]。大豆中的另一個ERF轉錄因子GmERF5可以被大豆疫霉菌、乙烯、脫落酸和水楊酸誘導表達，其啟動子的啟動活性還可以被高鹽和干旱脅迫所誘導[21]。

為了明確GmERF9P的低溫誘導表達特性，將該啟動子與GUS基因相連，構建成植物表達載體并轉化煙草。在低溫處理條件下，轉基因煙草中GUS基因表達量增加，證明該啟動子具有低溫誘導表達特性。同時也說明GmERF9P啟動子序列中的順式作用元件與轉錄因子相互作用，在分子水平上調節植物對低溫脅迫的抗性[1，22]。但是由于植物內基因表達調控方式非常復雜，在這些預測的順式作用元件中到底哪些發揮了作用還需進一步的驗證。另外我們也對GmERF9P在干旱和高鹽處理2 h下的誘導活性進行了鑒定，但與對照相比并沒有顯示出明顯差異，說明GmERF9P對非生物脅迫的響應是多方面而且復雜的，還可能涉及啟動子序列長度以及逆境處理時間等因素的影響，這方面仍需做進一步研究。本研究對了解逆境脅迫下植物ERF轉錄因子的分子調控機制具有重要的理論意義，同時為植物抗寒育種提供有利工具。

本研究利用PCR技術從大豆葉片基因組DNA中克隆1 885 bp的GmERF9P啟動子。序列分析表明GmERF9P序列中含有多種與逆境相關的順式作用元件。將GmERF9P構建到植物表達載體pCAMBIA1301上并轉化煙草。GUS組織化學染色和實時熒光定量PCR結果顯示，GmERF9P在低溫處理下能夠提高GUS基因的表達量，具有低溫誘導啟動活性。

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CloningandActivityAnalysisofColdInducedGmERF9PPromoterfromSoybean

ZHAI Ying1，ZHANG Jun2，REN Weiwei1，ZHANG Chuang1，ZHAO Yan1，ZHANG Meijuan1

(1.College of Life Science and Agro-Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China； 2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161005，China)

Promoters play a key role in the regulation of gene expression. The objective of this study is to isolate and characterize theGmERF9 promoter (GmERF9P) from soybean. TheGmERF9Pwas amplified with PCR from the genome DNA of soybean，which had a length of 1 885 bp. Sequence analysis indicated thatGmERF9Pcontained a number of stress-related elements. TheGmERF9Pwas cloned into plant expression vector of pCAMBIA1301 and transformed into tobacco NC89. The regenerated plants were analyzed by PCR and showed that the promoter fragments were integrated into six genomes of tobacco plants. Histochemical staining of GUS activity and Real-time fluorescent quantitative PCR of the transgenic plants showed that the expression ofGUSgene was increased under cold treatment for 2 h，which proved thatGmERF9Pwas an efficient cold-inducible promoter.

Soybean；GmERF9P；Promoter；Cold induced；Transgenic tobacco

2017-06-21

國家自然科學基金項目(31301335)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541889)；黑龍江省自然科學基金項目(C201458)；黑龍江省普通本科高等學校青年創新人才培養計劃(UNPYSCT_2016090)

翟 瑩(1982-)，女，吉林人，副教授，博士，主要從事大豆分子育種研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)05-0013-06

10.7668/hbnxb.2017.05.003