佐太和HgS對藥物代謝酶和轉運體基因表達的影響

張斌斌　徐尚?！⌒靵喩场￡戇h富　魏立新　劉杰

[摘要]藏藥佐太（主要含βHgS）和中藥朱砂（96%HgS）是傳統醫藥中的配伍成分，其含重金屬（汞）的安全問題和中西藥合用時的相互作用問題日益受到關注。本實驗就其對藥物代謝基因的影響進行了研究。小鼠連續7 d口服給予不同劑量佐太、HgS（10，30，100，300 mg·kg-1），或氯化汞（HgCl2，336 mg·kg-1），RTPCR檢測藥物代謝酶和轉運體蛋白相關基因表達。佐太和HgS對Ⅰ相（CYP1A2，CYP2B10，CYP3A11，CYP4A10）和Ⅱ相（UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1，SULT2A1）藥物代謝酶以及轉運體蛋白（OATP1A1，OATP1A4，OATP1B2，OATP2B1，MRP1，MRP2，MRP3，MRP4）均無明顯影響，而HgCl2顯著上調CYP2B10，CYP4A10，UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1，SULT2A1，OATP1A4，MRP1，MRP3，MRP4，對OATP1A1有抑制作用。綜上，佐太和HgS在300 mg·kg-1的劑量下對肝臟代謝基因的表達沒有產生明顯的影響，而1/10等汞量的HgCl2則明顯上調或改變Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝基因和轉運體基因的表達。

[關鍵詞]佐太； HgS； 氯化汞； 藥物代謝酶； 藥物轉運體； RTPCR

[Abstract]Zuotai and cinnabar（96%HgS） are contained in many traditional medicines To examine their potential effects on drug metabolism genes， mice were orally given Zuotai or HgS at doses of 10， 30， 100， 300 mg·kg-1 for 7 days HgCl2（336 mg·kg-1） was gavaged for control Twentyfour hour later after the last administration， livers were collected， and expressions of genes related to metabolic enzymes and transporters were examined Zuotai and HgS had no effects on major phase1， phase2 and transporter genes； HgCl2 increased the expressions of CYP2B10， CYP4A10， OATP1A4， UGT1A1， UGT2A3， SULT1A1， SULT2A1， MRP1， MRP3 and MRP4； expression of OATP1A1 was decreased by HgCl2， but not by Zuotai and HgS Therefore， Zuotai and HgS have different adverse effects on drugmetabolizing genes from HgCl2.

[Key words]Zuotai； HgS； HgCl2； drugmetabolizing enzyme； drug transporter； RTPCR

藏醫藥是世界傳統醫學中的重要組成部分，迄今已有上千年的使用歷史，是我國較為完整且具有影響的民族藥之一[12]。佐太是藏藥中最為核心的貴重藥物[1，34]，是許多名貴藏成藥中的主要原料藥之一，如七十味珍珠丸、二十五味松石丸等。朱砂首載于《神農本草經》中，稱之為丹砂[5]，其用藥已有2 000多年歷史，約7%的中成藥品種中都含有朱砂[6]，如朱砂安神丸、益元散、補心丸等。因佐太主要成分是硫化汞（βHgS），屬于含重金屬藏藥的典型代表；而朱砂主要化學成分為硫化汞（96%αHgS）。因此，佐太與朱砂的安全問題和中西藥合用時的相互作用問題日益受到關注[711]。但是，汞是重金屬物質，其毒性是毋庸置疑的，而佐太與朱砂中主要成分βHgS，αHgS與有毒汞化合物的安全性及其與藥物的相互作用是不一樣的[12]。

藥物代謝酶及轉運體是決定藥物體內吸收、分布、代謝、排泄、毒性與藥效過程（ADMET/Act過程）的關鍵因素，藥物對其抑制或誘導效應是產生藥動學相互作用的重要機制[13]。藥物相互作用是中藥副作用的一個重要因素[14]，而佐太和朱砂常配伍傳統藥物使用，與現代藥物合用也越來越多，因此，闡明佐太和朱砂（HgS）對藥物代謝酶基因和轉運體基因的表達，對于傳統藥物的基礎理論發展和臨床上的指導具有重要意義。但佐太和朱砂對藥物代謝基因的影響鮮有報道，故本實驗在研究其毒性基礎上[1112]進一步研究佐太和HgS對肝臟Ⅰ相、Ⅱ相、Ⅲ相代謝基因的影響。

1材料

11動物成年昆明雄性小鼠（25±2） g，購自重慶第三軍醫大學實驗動物中心，合格證號SCXK（渝）20120005，在SPF級動物房適應性飼養1周后用于實驗。

12藥物和試劑藏藥佐太由中國科學院西北高原生物研究所提供；硫化汞（HgS）和氯化汞（HgCl2）購買于SigmaAldrich公司；RNAiso Plus，PCR引物購自大連寶生物工程有限公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits為美國Applied Biosystems公司產品；iQTM SYBRGreen SuperMix購自美國BioRad公司；mRNA純化試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。

13儀器CFX connect型實時熒光定量PCR儀（美國BioRad公司）；5417R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Mastercycler gradient多功能梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；MULTISKAN GO全波長酶標儀（美國Thermo公司）；X15R型冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；YQ720C型超聲波清洗機（中國上海易凈超聲波儀器公司）。endprint

2方法

21動物分組及給藥小鼠隨機分為10組，每組6～8只，包括空白對照組（Control）、佐太不同劑量組（10，30，100，300 mg·kg-1，分別約相當于臨床用量的2，5，15，45倍）[11]、HgS不同劑量組（10，30，100，300 mg·kg-1）[9，12]及HgCl2組（336 mg·kg-1）?？瞻讓φ战M小鼠給予等量蒸餾水，其他各組灌胃給予不同劑量的佐太、HgS和HgCl2（HgS與佐太于雙蒸水中融合，在超聲波儀器中進行超聲，每次給藥前超聲30 min，藥物為混懸液），連續給藥7 d。在實驗結束時，記錄動物體質量和肝重，摘取肝臟用于進一步分析。

22實時熒光定量RTPCR法檢測用Trizol提取肝總RNA。NanoDrop2000紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，A260/A280均在18～20，用High Capacity RT 逆轉錄為cDNA，用IQTM SYBR Green Supermix進行PCR擴增。用Primer3來設計探針，以βactin做內參基因。用2ΔΔCt值法計算其擴增效率，比較不同組之間的基因表達差異。

23統計學分析實驗所有結果均以±s表示，全部數據采用SPSS 160軟件分析處理，單因素方差分析統計實驗結果，通過多重比較，以P<005為具有顯著性差異。

3結果

31佐太、HgS和HgCl2對細胞色素P450酶（CYP）表達的影響CYP是肝臟中主要的I相藥物代謝酶，見圖1，與空白組相比，佐太組和HgS組（10，30，100，300 mg·kg-1）對CYP1A2，CYP2B10，CYP3A11，CYP4A10 mRNA的表達無明顯影響，除HgS組上調CYP1A2 mRNA的表達，但無統計學意義。因佐太和朱砂含汞，所以用等汞量的HgCl2 來做比較。HgCl2 組336 mg·kg-1對CYP1A2，CYP3A11 mRNA的表達無明顯影響，但明顯升高CYP2B10，CYP4A10 mRNA的表達，分別為225，2倍。

32佐太、HgS和HgCl2對Ⅱ相結合酶反應基因表達的影響與空白組相比，佐太組和HgS組不同劑量下對UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1，SULT2A1 mRNA的表達無明顯影響，而HgCl2組336 mg·kg-1劑量可顯著升高UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1，SULT2A1 mRNA的表達，分別相當于空白組的2，15，15，33倍，見圖2。

33佐太、HgS和HgCl2對攝取轉運體基因表達的影響與空白組相比，佐太組和HgS組不同劑量下對OATP1A1，OATP1A4，OATP1B2，OATP2B1 mRNA的表達無明顯影響，但佐太組10，100 mg·kg-1可誘

導OATP1A4 mRNA約18，19倍，但無統計學意義。HgS組可升高OATP1A1 mRNA的表達，但無統計學意義。相比之下，HgCl2組336 mg·kg-1劑量可顯著上調OATP1A4 mRNA約28倍，下調OATP1A1 mRNA約為空白組的1/2。未發現佐太和HgS誘導相應攝取轉運體的表達，見圖3。

34佐太、HgS和HgCl2對外排轉運體基因的表達佐太組和HgS組對外排轉運體MRP1，MRP2，MRP3，MRP4 mRNA的表達無明顯影響，但HgS組300 mg·kg-1劑量升高MRP1 mRNA約14倍，但無統計學意義。而HgCl2組可分別升高MRP1，MRP3，MRP4 mRNA表達量約17，2，25倍。佐太和HgS不影響這些外排轉運體的表達，見圖4。

4討論

本研究比較了佐太和朱砂對小鼠肝臟藥物代謝酶和轉運體基因活性表達的影響。主要實驗的方法

是測定基因水平的差異性，在后續實驗中會測定活性表達及相關蛋白水平測定和免疫組化等方法，更深入探討相關機制。在本次實驗中共測定了15個基因水平的表達（P450有4個，Ⅱ相4個，轉運體7個），發現佐太和HgS在不同劑量下對CYP14家族基因、Ⅱ相結合酶反應基因和轉運體基因表達并沒有顯著影響。而相當于30 mg·kg-1HgS 含汞量的HgCl2 336 mg·kg-1則上調CYP2B10和CYP4A10；對于Ⅱ相結合酶基因，HgCl2對肝OATP1A1有抑制作用，對OATP1A4有誘導作用；對于轉運體基因，HgCl2對肝攝取轉運體（UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1，SULT2A1）有誘導作用，也可上調外排轉運體（MRP1，MRP3，MRP4）。因此，佐太和HgS對

小鼠肝臟藥物代謝酶基因和轉運體基因的表達影響不同于HgCl2。

佐太主要為βHgS（為黑色），朱砂則主要為αHgS（為紅色）。在10～300 mg·kg-1，其對藥物代謝基因的影響基本相似，沒有明顯差別。這與作者觀察到的毒性作用一致[12]。

藥物代謝是指藥物分子被機體吸收后發生化學結構轉化的過程，其對藥物的藥效、毒性、作用時間、藥物相互作用等都具有重要的影響。

藥物進入機體后的生物轉化主要有Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝。多數藥物進入體內后是在細胞特異酶的催化作用下發生代謝反應。CYP酶系是最主要的Ⅰ相代謝酶系，在肝臟中含量較高，具有廣泛的生物學意義[15]。臨床上約90%的藥物是通過CYP代謝，包括藥物在內的多種內源性和外源性物質代謝，Ⅰ相反應與藥物的清除率有直接的關系[16]。與空白組相比，佐太和HgS對肝中CYP酶中14家族中的CYP1A2，CYP2B10，CYP3A11，CYP4A10基因活性表達無明顯影響，HgS略下調CYP2B10和CYP4A10，但無統計學意義。而相當于30 mg·kg-1HgS含汞量的HgCl2則會顯著上調CYP2B10和CYP4A10。CYP1A2在CYP1家族中與藥物代謝關系最密切，主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的13%[1617]。CYP3A4在CYP3亞族中含量最為豐富，主要存在肝臟和小腸中[16]。人類中優勢表達的CYP3A酶為CYP3A4，而在小鼠中則為CYP3A11，兩者功能類似[18]。本實驗表明佐太和HgS高達300 mg·kg-1對P450相關基因表達無明顯影響，而1/10等汞量的HgCl2則可產生明顯影響。endprint

Ⅱ相反應即結合反應，包括硫酸化、葡萄糖醛酸化等反應，主要是使藥物以非活性形式排出體外。Ⅱ相代謝中最主要的酶是葡萄糖醛酸轉移酶（UGT）系，UGT在肝臟中的表達最高且具有多態性，約35%的藥物Ⅱ相反應都由UGT酶代謝。UGT1A1基因的產物尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶1A1的主要作用是使各種不同外源性藥物和內生底物葡萄糖醛酸化，增加其底物的極性，從而能更好地從體內被清除[19]。與空白組相比，佐太和HgS不同劑量對肝UGT1A1和UGT2A3都無明顯影響，而相當于30 mg·kg-1HgS含汞量的HgCl2 （336 mg·kg-1）上調UGT1A1和UGT2A3。硫酸基轉移酶（SULT）是機體催化多種內源性和外源性物質的重要酶系。SULT1和SULT2是硫酸酯化代謝的關鍵酶，SULT1A1在肝臟中有很高的表達量，為重要的解毒酶類。與空白組相比，佐太和HgS對肝SULT1A1和SULT2A1無明顯作用，而相當于30 mg·kg-1HgS含汞量的HgCl2 （336 mg·kg-1）可上調SULT1A1和SULT2A1。Ⅱ相代謝酶的表達，Ⅱ相代謝酶表達的增高能夠有效地減少各種外源性物質引起的相關疾病[20]。Ⅰ相代謝酶類主要是初次發揮作用并為藥物排出體內創造條件，如在藥物分子上增加極性基團，而Ⅱ相代謝才是真正的“解毒途徑”，所得到的產物通常具有更好的水溶性，更容易經膽汁和/或尿液排出體外[21]。肝臟是外源物質代謝作用和解毒作用發生的主要場所，而肝臟中含有大量的藥物代謝酶。UGT和SULT是主要的Ⅱ相代謝酶，參與藥物結合代謝，對進入機體的外源性毒物有解毒和保護作用[22]。研究表明，UGT主要是催化大多數藥物、致癌物、毒物等與葡萄糖醛酸基結合后代謝、解毒、排泄[23]。UGT1A1，UGT2A3，SULT1A1和SULT2A1有明顯的誘導作用，這也許是機體對HgCl2中毒的解毒機制之一，說明HgCl2是毒物，誘導機體的解毒酶表達加速代謝排出毒性化學物質。本實驗表明佐太和HgS高達300 mg·kg-1的劑量對于Ⅱ相結合酶基因表達無明顯作用，而1/10等汞量的HgCl2則可產生明顯影響。

藥物轉運蛋白是藥物載體的一種跨膜轉運蛋白。研究發現藥物轉運蛋白主要有多耐藥相關蛋白（MRP）、有機陰離子轉運多肽（OATP）等[24]。按轉運體機制和方向的不同，轉運體又可分為攝取性轉運體和外排性轉運體，可影響藥物在肝的分布和清除過程[25]。藥物進入體內經過Ⅰ相和Ⅱ相代謝后，再通過調節轉運蛋白的活性而改變其轉運藥物的能力，即可提高或降低藥效。藥物在體內的過程受生物膜的影響，藥物能否通過生物膜不僅取決于藥物的理化性質，受轉運蛋白的影響[2526]。OATP是轉運內源性和外源性化合物的膜蛋白，其可使多種藥物從血液向膽汁轉運排出體外，從而使藥物的作用減弱或消失，達到肝臟滅活解毒的功能[14，25]。OATP1A1，OATP1B2是藥物毒物的主要轉運體，與空白組相比，佐太和HgS對肝OATP1A1，OATP1A4，OATP1B2，OATP2B1無影響，HgS會略上調OATP1A1，OATP1A4和OATP1B2，但無統計學意義。而HgCl2誘導OATP1A1和OATP1A4。佐太和HgS對肝MRP14家族無明顯影響，而相當于30 mg·kg-1HgS含汞量的HgCl2可上調MRP1，MRP3，MRP4。MRP是細胞主要的外排泵，清除藥物和毒物，主要是與葡萄糖醛酸基和硫酸酯基結合了毒物或藥物。本實驗表明佐太和HgS高達300 mg·kg-1的劑量對肝轉運體無明顯影響，而1/10等汞量的HgCl2則可產生明顯影響。作者近期研究進一步發現佐太和HgS不同于HgCl2和甲基汞對腎臟轉運體的影響，老年動物更對HgCl2和甲基汞的腎毒性敏感[27]。

藥物代謝酶的表達以及活性的改變是直接影響機體對藥物處置過程的重要原因，會導致藥物的不良反應的發生[14]。肝臟作為藥物在機體中消除的器官，其組織細胞上分布的轉運體在影響藥物體內藥動學過程中具有重要地位[25]。本實驗研究了不同劑量的佐太和HgS對小鼠肝臟藥物代謝酶和轉運體基因表達的作用。佐太和HgS在高達300 mg·kg-1的劑量下對肝Ⅰ相、Ⅱ相和Ⅲ相（轉運體）藥物代謝酶基本無影響，而1/10等汞量的HgCl2則明顯上調或改變Ⅰ相、Ⅱ相藥物代謝基因和轉運體基因的表達，進一步說明不能以HgCl2的作用來評價佐太和朱砂（HgS）的毒性和潛在的藥物相互作用。

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[責任編輯張寧寧]endprint