鋅脅迫對黑水虻幼蟲抗氧化酶活性和血細胞凋亡率的影響

馮 群，廖 業，方 旭，杜聯峰，陳 陽，夏 嬙

(遵義醫學院珠海校區 免疫學教研室,廣東 珠海 519041)

鋅脅迫對黑水虻幼蟲抗氧化酶活性和血細胞凋亡率的影響

馮 群，廖 業，方 旭，杜聯峰，陳 陽，夏 嬙

(遵義醫學院珠海校區 免疫學教研室,廣東 珠海 519041)

目的探討Zn2+長期脅迫對黑水虻幼蟲血淋巴抗氧化酶和血細胞凋亡率的影響，為黑水虻幼蟲在無害化處理糞便中的應用及其副產品的開發提供理論依據，同時豐富重金屬對昆蟲酶活性及凋亡率影響的研究內容。方法將不同濃度的Zn2+添加到人工飼料中，對黑水虻幼蟲進行連續5代的脅迫。收集不同處理濃度第1、3、5代5齡末幼蟲血淋巴，利用分光光度計測定GST、GST-Px活性及SOD活力，用流式細胞儀檢測血細胞的凋亡率。結果第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GST及GSH-Px活性在75～300 mg/kg處理范圍內隨著Zn2+濃度的增加而升高，在600～1 200 mg/kg范圍內則隨Zn2+處理濃度的增加而降低；SOD活力在各濃度均隨Zn2+增加而降低。隨著脅迫世代增加，GSH-Px活性及SOD活力降低，GST活性升高，但GST活性在第1、5代的差異不顯著。當Zn2+處理濃度增至600～1 200 mg/kg時，Zn2+脅迫顯著誘導了血細胞的凋亡，且凋亡率隨世代的增加而增加。結論Zn2+脅迫對黑水虻幼蟲的抗氧化酶活性及血細胞凋亡率均有影響，并且隨世代的增加而改變。

黑水虻；鋅；酶活性；凋亡率

黑水虻(blacksoldierfly，Hermetiaillucens)屬雙翅目水虻科資源昆蟲，廣泛分布，其幼蟲主要以腐爛的有機物、動物糞便和植物為食物來源,已被公認是可持續管理動物廢物的一種有效方法[1-2]。研究發現，黑水虻幼蟲集中取食糞便時，不僅可以減少糞便的堆積和臭氣[3]，還能減少糞便中大腸桿菌、沙門氏菌及寄生蟲卵數量[4-5]。此外，黑水虻幼蟲、預蛹和蛹中含有豐富的蛋白質、脂肪、氨基酸和微量元素[6-8]，是目前經濟價值較高的動物飼料來源[9]。因此，利用黑水虻幼蟲進行糞便無害化處理是一條節約化、資源化的可循環道路。如今已有許多國家進行黑水虻無害化處理糞便系統的開發和應用[10]，我國也進行了相應的研究和開發[11-13]。

隨著對Zn的不斷認識，飼料加Zn已成一種普遍現象，但過量的Zn會影響機體對其他元素的吸收利用，對飼養對象的存活構成重大威脅[14]。姚麗賢等通過對比實驗發現豬飼料Zn2+含量嚴重超標[15-17]，發現過量的Zn2+既可以影響昆蟲的生長發育，還對其生理生化指標及免疫系統產生影響。吳海一研究Zn2+對扁額細首紐蟲Cephalothrix simula抗氧化防御系統及脂質過氧化作用實驗發現，高濃度Zn2+不僅影響扁額細首紐蟲體內抗氧化酶GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)活性及脂質過氧化反應[18]，還顯著誘導斜紋夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)幼蟲血細胞的凋亡[19]。近年來，生物體內的抗氧化酶系統變化己被應用于評價和監測外源污染物的毒性效應[20]。目前為止，大多報道都涉及對昆蟲抗氧化酶、生長發育的影響[21]。在重金屬脅迫對昆蟲血細胞凋亡以及凋亡與氧化應激兩者之間的關系方面的研究鮮有報道。

本實驗前期結果表明，超標的Zn2+可以在黑水虻體內累積且對其生長發育產生影響，然而，是否會對黑水虻幼蟲的抗氧化能力及血細胞凋亡率產生影響，進而影響其免疫功能則是我們所關注的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗昆蟲 由珠海市現代農業發展中心提供。

1.1.2 主要儀器 UV752紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司，電子分析天平(FA2004B)：上海佑科儀器儀表有限公司，流式細胞儀(FACS Calibur)：美國Becton Dickinson公司，臺式高速冷凍離心機、臺式低速離心機(SC-3610)：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑 ZnSO4·7H2O：天津市大茂化學試劑廠，分析純，GST(谷胱甘肽S-轉移酶)檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒：南京建成科技有限公司，Annexin -V/PI 凋亡檢測試劑盒：Invitrogen。

1.2 試驗方法

1.2.1 Zn2+脅迫下黑水虻實驗種群的建立及血淋巴的制備 參照夏嬙等[22]報道的方法，在幼蟲人工飼料中添加不同濃度Zn2+(75 mg/kg、150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg、1 200 mg/kg)，對黑水虻實驗種群進行連續5代脅迫，以不添加Zn2+飼料所飼養的黑水虻幼蟲為對照組(記為0 mg/kg)。

取不同濃度Zn2+脅迫下大小相同、長勢均一的第1、3、5代5齡末黑水虻幼蟲各50只，用雙蒸水洗去蟲體表面殘余飼料，酒精棉球消毒蟲體，眼科剪剪掉頭部，用毛細吸管自頭部斷面處吸取血淋巴，將采集的各世代、各處理濃度下的血淋巴分別放入預先置于冰上加有苯基硫脲的Eppendorf 管中混勻，于4 ℃離心力750 g條件下離心5 min，取上清液。

1.2.2 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴抗氧化酶活性的影響 按照GST、GST-Px及SOD(U/mL)試劑盒說明書配制試劑，取1.2.2中的血淋巴上清液，按相應試劑盒的上樣量要求上樣，利用分光光度計法分別于波長412 nm和550 nm處測定各管A值，每個處理3個重復，取平均值代入各酶活力的計算公式，得結果作圖。

1.2.3 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血細胞凋亡率的影響 同樣取1.2.1來源的血淋巴，在Eppendorf 管中加入1 mL PBS重懸細胞，于離心力80 g離心5 min，使血細胞沉淀后棄上清，留300 μL液體，加入200 μL結合液重懸細胞后，加入5 μL Annexin-v吹勻，室溫避光10 min，再加入5 μL PI室溫避光5 min。以正常單染的細胞為對照組，正常未染的細胞為空白對照，利用流式細胞儀在波長488 nm下檢測凋亡率，每個處理3個重復。

2 結果

2.1 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴抗氧化酶活性的影響

2.1.1 不同濃度Zn2+脅迫對GST活性的影響 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GST活性影響及方差分析見圖1。第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GST活性均在75～300 mg/kg處理范圍內隨Zn2+濃度的增加而增加，且隨世代增加而升高，處理濃度增至300 mg/kg時GST活性最高，與對照組活性相比顯著增加(Plt;0.01)；在600～1 200 mg/kg處理范圍內GST活性隨Zn2+脅迫濃度的增加而降低，當脅迫濃度為1 200 mg/kg時，各世代GST活性與對照相比均顯著降低(Plt;0.05)，且1 200 mg/kg Zn2+處理組中，第3代黑水虻幼蟲血淋巴中GST活性高于第1、5代，但第1、5代相同濃度處理下GST活性無明顯差異(Pgt;0.05)。

同一世代折線圖上不同的小寫字母表示同一世代不同處理組間差異顯著(Plt;0.01)；同一濃度處理組折線圖上不同大寫字母表示不同世代間差異顯著(Plt;0.05)。

圖1 不同濃度Zn2+脅迫下第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GST活性變化

2.1.2 不同濃度Zn2+脅迫對GSH-Px活性的影響 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GSH-Px活性影響及方差分析見圖2。第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GSH-Px活性均在75～300 mg/kg處理范圍內隨Zn2+濃度的增加而增加，處理濃度至300 mg/kg時GSH-Px活性最高，且與對照組活性相比顯著增加(Plt;0.01)；在600～1 200 mg/kg處理范圍內GSH-Px活性隨Zn2+脅迫濃度的增加而降低，各世代GSH-Px活性與對照相比均顯著降低(Plt;0.05)。第5代黑水虻幼蟲血淋巴中GSH-Px活性均顯著低于第1、3代在相同處理濃度下GSH-Px的活性(Plt;0.05)。

同一世代折線圖上不同的小寫字母表示同一世代不同處理組間差異顯著(Plt;0.01)；同一濃度處理組折線圖上不同大寫字母表示不同世代間差異顯著(P lt;0.05)。 圖2 不同濃度Zn2+脅迫下第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中GSH-Px活性變化

2.1.3 不同濃度Zn2+脅迫對SOD活性的影響 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中SOD活力影響及方差分析見圖3。第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中SOD活力隨Zn2+濃度的增加而減弱，且隨世代增加SOD活力下降。在75～300 mg/kg Zn2+處理濃度下第1、3代黑水虻幼蟲血淋巴SOD活力顯著高于對照組；在600 mg/kg以上處理濃度時各世代幼蟲血淋巴中SOD活力均低于對照組。這趨勢隨世代增加而越明顯，即第5代黑水虻幼蟲血淋巴中SOD活力在各個濃度的Zn2+脅迫下均顯著低于第1、3代幼蟲血淋巴中SOD活力(Plt;0.01)。

2.2 不同濃度Zn2+脅迫對血細胞凋亡率的影響 不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血細胞的凋亡率影響及方差分析見表1和圖4～6。第1代黑水虻幼蟲血細胞在75～300 mg/kg Zn2+處理濃度下的凋亡率變化不顯著，且第3、5代血細胞凋亡率變化沒有明顯規律性；在600～1 200 mg/kg Zn2+脅迫下顯著誘導了第1、3、5代黑水虻幼蟲血細胞的凋亡，且其凋亡率顯著高于對照組(Plt; 0.01)。隨脅迫世代增加至第5代，除300 mg/kg處理濃度外，其他處理組的凋亡率均顯著高于第1、3代血細胞凋亡率(Plt;0.05)。

同一世代折線圖上不同的小寫字母表示同一世代不同處理組間差異顯著(Plt;0.01)；同一濃度處理組折線圖上不同大寫字母表示不同世代間差異顯著(Plt;0.05)。 圖3 不同濃度Zn2+脅迫下第1、3、5代黑水虻幼蟲血淋巴中SOD活力變化

表1不同濃度Zn2+脅迫對第1、3、5代黑水虻幼蟲血細胞凋亡率的影響

處理濃度(mg/kg)血細胞凋亡率(x±s)%第1代第3代第5代03.64±0.17cA3.50±0.23eA3.96±0.64eA754.01±0.14cC5.87±0.62cB7.26±0.85cA1503.21±0.27cC4.71±0.34dB6.79±0.93cdA3002.68±0.19dB4.11±0.35deA4.79±0.46deA6006.13±0.29bC8.11±1.10bB12.09±0.65bA12007.88±0.53aB9.85±0.45aB14.83±2.36aA

表中同一列平均數后不同小寫字母表示不同處理組間存在顯著差異；其中，第1代，F=140.553，Plt;0.01；第3代，F=53.168，Plt;0.01；第5代，F=40.537，Plt;0.01。表中同一行平均數后不同大寫字母表示不同世代間存在顯著差異；其中，0 mg/kg：F=1.044，Pgt;0.05；75 mg/kg：F=21.648，Plt;0.01；150 mg/kg：F=28.330，Plt;0.01；300 mg/kg：F=28.906，Plt;0.01；600 mg/kg：F=48.772，Plt;0.01；1 200 mg/kg：F=19.115，Plt;0.01。

A：0 mg/kg； B：75 mg/kg； C：150 mg/kg； D：300 mg/kg； E：600 mg/kg； F：1 200 mg/kg，X軸為Annexin-V染色細胞數，Y軸為PI染色細胞數；左上象限:機械損傷細胞；右上象限:晚期凋亡及壞死細胞；左下象限:正常細胞；右下象限:早期凋亡細胞(下同)。圖4 不同濃度Zn2+脅迫下第1代黑水虻幼蟲血細胞凋亡流式分析圖

A：0 mg/kg； B：75 mg/kg； C：150 mg/kg； D：300 mg/kg； E：600 mg/kg； F：1 200 mg/kg。圖5 不同濃度Zn2+脅迫下第3代黑水虻幼蟲血細胞凋亡流式分析圖

A：0 mg/kg； B：75 mg/kg； C：150 mg/kg； D：300 mg/kg； E：600 mg/kg； F：1 200 mg/kg。圖6 不同濃度Zn2+脅迫下第5代黑水虻幼蟲血細胞凋亡流式分析圖

3 討論

本文研究的抗氧化酶GST、GSH-Px和SOD是清除自由基的關鍵酶類，其活性高低可反映細胞中過氧化物的多少及膜脂質過氧化程度[23]，是預警有毒物質對生物體損害的敏感性生物標志物。結果表明，GST活性在不同濃度Zn2+脅迫下的變化趨勢不同，低濃度(75～300mg/kg)脅迫升高，高濃度(600～1200mg/kg)脅迫降低，與Pb2+暴露對家蠶組織GST活性的影響相一致[24]，可能機制即低濃度脅迫時昆蟲機體啟動了抗氧化防御保護系統，而高濃度則導致拒食，亦或高濃度脅迫產生過剩的自由基損害機體；GSH-Px是一種含硒的抗氧化酶，變化趨勢與GST相同，不過在低濃度酶活性的升高還可能與GST聯合清除自由基有關，緩解氧化脅迫對機體的損傷，實現解毒功能，而高濃度Zn2+脅迫造成黑水虻幼蟲組織不可逆損傷,隨著脅迫時間和濃度的累積,導致酶GSH-Px活性降低，由此可看出，GSH-Px具有預示組織受損嚴重程度的潛力；金屬酶SOD對金屬脅迫十分敏感，與CAT(過氧化物酶)協作構成生物體抵御逆境的第一道防線[25]，參與機體免疫功能的調節，此外，其細胞內外的數量變化還與氧化應激相關的疾病密切相關。本文SOD活力與Zn2+濃度變化呈負相關，機制與高濃度作用下的GSH-Px變化類似，結果與高濃度污染物對蚯蚓[26]和果蠅[27]的報道一致。但與劉佳等[28]報道稱Zn2+能促進抗氧化保護的結果不相符，可能與昆蟲的類型和發育階段及性別差異有關。

重金屬的種類及價態的具有多樣性，誘導細胞凋亡的機制非常復雜，本研究中高濃度Zn2+脅迫顯著誘導了黑水虻幼蟲血細胞的凋亡，機理可能如劉曉華等[29]所報道：即活性氧主要產生于線粒體,當生物體內氧化還原平衡一旦被打破,線粒體功能異常，產生更多的氧自由基,反過來又會加重線粒體、酶、膜脂質損傷,使線粒體釋放細胞色素c(Cytc)進入胞漿，從而啟動線粒體參與細胞凋亡通路介導細胞凋亡，表明抗氧化能力的減弱能促進細胞的凋亡。當然，其他機制如DNA的直接破壞、MARKs通路的激活等也可能參與其中，但具體過程還需深入研究。

綜上所述，高濃度Zn2+長期脅迫影響了黑水虻幼蟲抗氧化防御系統和血細胞凋亡率，且隨世代變化而變化，間接影響黑水虻無害化處理糞便系統和副產品的研發，同時，就重金屬嚴重污染的現狀給了人們一個重要的提示。

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[收稿2017-07-14;修回2017-09-10]

(編輯：譚秀榮)

基礎醫學研究

基礎醫學研究

EffectsofdietaryzincstressonantioxidantenzymeactivityandbloodcorpuscleapoptosisrateinH.illucenslarvae

FengQun,LiaoYe,FangXu,DuLianfeng,ChenYang,XiaQiang

(Department of Immunology,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Zn2+stress on antioxidant enzymes in the haemolymph and blood corpuscleapotosis rate ofH.illucenslarvae,and further provide the theoretical basis for the application ofH.illucenslarvae harmless treatment manure and the development of subsidiary products.MethodsDifferent concentrations of Zn2+into artificial diets stress were added onH.illucenslarvae for continuous 5 generations.Hemolymph of different treatment concentration of 1st,3rd and 5th generations of 5 instar larva was collected.The activity of GST,GST-Px and SOD activity were measured by spectrophotometry and the blood corpuscle apoptosis rate was measured by flow cytometry.ResultsThe activity of GST and GSH-Px in the haemolymph of 1st,3rd and 5th generationsH.illucenslarvae were increased with the increase of Zn2+concentration in the range of 75～300 mg/kg,but were decreased with the increase of Zn2+concentration in the range of 600～1 200 mg/kg.The SOD activity was decreased with the increase of Zn2+concentration at each treatment concentration.As the increase of the stress generations,the GSH-Px and SOD activity were decreased and GST activity was increased,but no significant difference of GST activity between 1st and 5th stress generations was shown.When Zn2+was increased to 600～1 200 mg/kg,Zn2+significantly induced the blood corpuscle ofH.illucenslarvae apoptosis,and the apoptosis rate was increased with the increase of the sress generations.ConclusionZn2+stress onH.illucenslarvae has effects on antioxidant enzyme activity and blood corpuscle apoptosis rate along with the increase of the generations.

Hermetia illucens; zinc; enzymes activity; apoptosis rate

國家自然科學基金資助項目(NO：31260528)；貴州省教育廳創新群體重大研究項目(NO：黔教合KY字[2016]037)。

夏嬙，女，教授，碩士生導師，研究方向：Zn2+、Cu2+在黑水虻體內累積及其影響，E-mail:xiaqiang1973@126.com。

S899

A

1000-2715(2017)05-0504-06