芒柄花素平衡溶解度和油水分配系數的測定

廖燦城，許丹翹，劉曉紅，吳秀君 ，黃澤賢 ，易 軍，郭波紅*

（1.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006；2.廣東省婦幼保健院，廣東廣州510010）

芒柄花素平衡溶解度和油水分配系數的測定

廖燦城1，許丹翹1，劉曉紅1，吳秀君2，黃澤賢1，易 軍1，郭波紅1*

（1.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006；2.廣東省婦幼保健院，廣東廣州510010）

目的 測定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系數，為設計芒柄花素新劑型提供理論基礎與依據。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法測定芒柄花素在水、不同緩沖鹽溶液中的質量濃度，并運用搖瓶法測定芒柄花素在正辛醇-水、緩沖液體系中的表觀油水分配系數。結果 37℃下芒柄花素在水中的平衡溶解度為2.079±0.036μg·mL-1，隨著pH值增大，芒柄花素的平衡溶解度增大。芒柄花素在正辛醇-水體系中的表觀油水分配系數lg Papp=2.79±0.03，隨著緩沖鹽溶液的pH值增大，芒柄花素在正辛醇-緩沖鹽溶液體系中的油水分配系數減小。結論建立的方法可以準確測定芒柄花素的平衡溶解度和表觀油水分配系數，科學合理地預測藥物在體內的吸收與分布情況。

芒柄花素；平衡溶解度；高效液相色譜法；油水分配系數

近年來發現，芒柄花素（7—羥基—4′—甲氧基異黃酮）是一種異黃酮類化合物，主要存在于紅車軸草［1］、刺芒柄花［2］、黃芪［3］等植物中，其化學結構見圖1。芒柄花素具有較好的抗腫瘤作用，已被應用于乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌等治療，此外還有治療骨質疏松、改善婦女更年期癥狀等用途，因而備受關注［4-9］。測定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系數對研究其體內過程，可以比較科學合理地預測藥物的生物利用度，為新劑型的設計開發提供了處方前研究的基礎，對指導臨床用藥也有著重要的意義。因此，本次試驗采用高效液相色譜（HPLC）法測定芒柄花素的質量濃度，并運用搖瓶法測定油水分配系數，為其設計劑型提供研究基礎。

圖1 芒柄花素的化學結構圖

1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Sartorius BS110S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；PKZ-1電熱恒溫振蕩水槽（上海精密實驗設備有限公司）；芒柄花素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111703-201504）；芒柄花素原料藥（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度≥98%，批號：C-018-150728）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（AR級，廣州化學試劑廠）；甲醇（色譜純，北京迪馬公司）；水為超純水，其余試劑為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 芒柄花素分析方法的建立

2.1.1 溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取適量芒柄花素對照品，加甲醇使之溶解，制成濃度為30μg·mL-1的對照品儲備液。從對照品儲備液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，得到濃度為6μg·mL-1的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取適量芒柄花素原料藥，加甲醇使之溶解，制成濃度為30μg·mL-1芒柄花素供試品儲備液。從供試品儲備液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，得到濃度為6μg·mL-1的供試品溶液。

不同pH磷酸鹽緩沖液的制備：按照2015版《中國藥典》第四部中通則的磷酸緩沖鹽溶液配制方法進行制備。

2.1.2 測定波長的選擇

取適量芒柄花素對照品加甲醇溶解，在波長200～800 nm進行掃描，芒柄花素在波長249 nm處有最大吸收峰，磷酸緩沖鹽溶液在此波長處無吸收，不干擾芒柄花素的測定，因此選定249 nm作為檢測波長。

2.1.3 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為Dikma Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸的水溶液（體積比為70∶30），檢測波長 249 nm，進樣量 20 μL，流速 1mL·min-1，柱溫 30 ℃。

2.1.4 線性關系考察

分別從芒柄花素儲備液中依次精密移取0.25、0.5、1、2、4、8mL分別至于10mL容量瓶中，再用流動相分別稀釋定容，搖勻得到0.75、1.5、3、6、12、24 μg·mL-1的系列濃度的芒柄花素對照品溶液，過 0.45 μm微孔濾膜，進樣測定含量。由芒柄花素峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=130.71 X+16.272，γ=0.999 7，表明 0.75～24 μg·mL-1線性關系良好

2.1.5 專屬性實驗

取流動相、供試品溶液、對照品溶液分別按設定的色譜條件進樣，記錄圖譜，結果見圖2，可見芒柄花素峰形良好，溶劑無干擾，專屬性良好。

圖2 芒柄花素高效液相色譜圖

2.1.6 精密度實驗

取低、中、高濃度分別為1.5、6、24μg·mL-1的芒柄花素對照品溶液，按照“2.1.3”項下的色譜條件，連續進樣6次，得色譜圖峰面積積分并計算其相對標準偏差（RSD）分別為0.35%、0.28%、0.39%（n＝6）。24、48、72 h后平行操作，得到日間精密度的RSD分別為0.35%、0.12%、0.53%（n=3），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 回收率實驗

依次從供試品儲備液中精密量取0.25、1、4mL分別置于5mL容量瓶中，加流動相定容至刻度線，得到濃度為1.5、6、24μg·mL-1的低、中、高濃度的芒柄花素供試品溶液，每種濃度的芒柄花素供試品溶液制備3份，共9份。按“2.1.3”項下色譜條件進樣，按標準曲線法計算含量，分別計算回收率，結果平均回收率分別為101.72%±0.44%、98.60%±0.25%、99.20%±0.39%，表明該方法的回收率符合要求。

2.1.8 穩定性試驗

取芒柄花素供試品溶液，在 0、4、8、12、24、36、48、72 h，分別進樣 20 μL，測定峰面積，結果 RSD 為0.57%。表明供試品溶液在72 h內穩定。

2.1.9 檢測限與定量限

逐步稀釋對照品溶液，當信噪比S/N=3∶1確定檢測限，信噪比S/N=10∶1確定定量限，結果芒柄花素的檢測限為 0.024 8 μg·mL-1，定量限為 0.0744 μg·mL-1。

2.2 芒柄花素的平衡溶解度測定［10］

取若干份過量芒柄花素置于100 mL具塞三角瓶中，分別加入水或 pH 值 2.0，5.0，5.8，6.8，7.4，8.0 磷酸鹽緩沖溶液，超聲至芒柄花素不再溶解，置于37℃水浴恒溫振蕩器，150 r·min-1振搖48 h，取適量經0.45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，續濾液用流動相稀釋至一定濃度后進樣。由標準曲線計算芒柄花素在不同pH磷酸緩沖液中的溶解度，結果見表1。結果表明芒柄花素在水或不同pH值磷酸鹽緩沖液中幾乎均不溶，在堿性環境中的溶解度略優于酸性環境，提示芒柄花素在胃腸中溶解性很差。

表1 芒柄花素在水或不同pH值磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度

2.3 芒柄花素的油水分配系數測定

2.3.1 正辛醇飽和溶液的制備［11］

取一定體積正辛醇溶液加入等體積水中密封后置于磁力攪拌器上，37℃恒溫攪拌24 h，轉移至分液漏斗內，靜置數小時后，分別取上層水飽和的正辛醇及下層正辛醇飽和的水備用。

2.3.2 表觀油水分配系數測定［12-13］

取適量芒柄花素加入一定體積水飽和正辛醇，超聲至充分溶解后，經0.45μm微孔濾膜濾過，制備芒柄花素-正辛醇溶液，取適量進樣，測定其在水飽和正辛醇中的濃度C1；取上述一定體積芒柄花素-正辛醇溶液置于具塞三角瓶中，再分別按1∶5的體積比例加入相應體積正辛醇飽和的各pH磷酸鹽緩沖溶液，置于37℃水浴恒溫振蕩器中，150 r·min-1振蕩48 h，靜置分層，取下層水相適量，經0.45μm微孔濾膜濾過，進樣并計算濃度C2，按照下式計算芒柄花素的表觀油水分配系數Papp，結果見表2。

實驗結果表明，芒柄花素在水中的表觀分配系數為616.6（lg Papp=2.79），在一定pH范圍內，芒柄花素的表觀油水分配系數隨著pH的增大而減小，在pH8.0緩沖液中的表觀分配系數最小為257（lg Papp=2.41）。

3 討論

表2 芒柄花素在各pH值的正辛醇/磷酸緩沖液的表觀油水分配系數

目前測定藥物油水分配系數最常用的方法是搖瓶法，在理論上并沒有對正辛醇-水的比例進行規定，只是從原則上進行指導，水相的體積可以根據藥物在水中溶解度的大小而進行相應地調整。在預實驗中，按照“2.3”項下的操作，發現正辛醇-水相的比例為1∶5時，水相中藥物濃度既可以滿足HPLC的測定，又符合藥物在油-水混合體系任一相中的濃度不超過0.01 mol·L-1的要求［14］，因此在選擇1∶5的比例測定芒柄花素的油水分配系數。另外取水樣時，為避免正辛醇的污染，可利用帶針頭的玻璃注射器來取水樣。首先在注射器內吸入部分空氣。當注射器通過正辛醇相時輕輕排出空氣，在水相中吸取足夠的水量后，迅速從溶液中抽出注射器，拆下針頭后，即可獲得無正辛醇污染的水相［13］。

實驗結果顯示，pH值對芒柄花素油水分配系數有一定的影響，pH=2.0時，lg Papp=3.23±0.03；pH=8.0時，lg Papp=2.41 ± 0.01。據文獻[12]報道，lg P＜-1或lg P＞5的化合物吸收都比較差；-1＜lg P＜5時，可以口服給藥且在腸道中較易被吸收；而當藥物lg P＜0時，適合血管給藥。胃腸道不同部位的pH值分別為胃 1～3，十二指腸 4～6，空腸 6～7，回腸、結腸 7～8［15］。由此可見芒柄花素的水溶性稍提高，其將會在整個胃腸道都有較好的吸收，提示可利用環糊精等材料包合芒柄花素制備芒柄花素的口服制劑，以提高其生物利用度。

平衡溶解度與表觀分配系數實驗可以較為客觀合理地模擬藥物在生物體內的水相和生物相之間的分配情況，對于預測藥物的滲透性及其生物利用度具有重要意義。芒柄花素在水中幾乎不溶，溶解度僅為2.08±0.15μg·mL-1，而其油水分配系數為616.6（lg Papp=2.79）。根據生物藥劑學分類系統（BCS）進行分類［16］，芒柄花素屬于Ⅱ類低溶解性、高滲透性藥物，溶出速率將會成為吸收的限速過程，因此制備芒柄花素口服制劑的關鍵在于增加藥物在體內的溶出度。目前有效改善BCSⅡ類藥物的溶出速率的常用方法有：微粉化、晶型修飾、環糊精包合、自乳化或制備成脂質體、固體分散體、納米乳等劑型。

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Determination of equilibrium solubility and oil/water partition coefficient of formononetin

LIAO Can-cheng1,XU Dan-qiao1,LIU Xiao-hong1,WU Xiu-jun2,HUANG Zexian1,YIJun1,GUOBohong1
（1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong Women and Children Hospitaland Health Institute,Guangzhou 510010,China）

Objective To determine the equilibrium solubility and the apparent oil/water partition coefficient of formononetin for designing new formulations.Methods The mass concentration of formononetin in water or phosphatebuffer with differentpH wasdetected by HPLC,and theshake flaskmethod wasused to determine the apparent partition coefficient of formononetin in n-octanol-water-buffer solutions of different pH.Result The equilibrium solubility of formononetin was 2.079±0.036μg·mL-1 in water at 37℃ and increased with the pH of buffer solution increasing.lg Pappof formononetin was 2.79±0.03 in n-octanol-water system and decreased with the pH of buffer solution increasing.Conclusion Themethods founded in this research can be used to determine accurately the equilibrium solubility and apparent partition coefficient of formononetin,and predict the in vivo absorption and distribution of formononetin.

formononetin;equilibrium solubility;HPLC;partition coefficient

R927

A

1008-0171（2017）06-0071-05

2017-10-20

國家自然科學基金項目（81403111）

廖燦城（1993-），男，廣東博羅人，廣東藥科大學藥劑學研究生。

*通信作者：郭波紅（1976-），女，湖南長沙人，廣東藥科大學副教授。

鄧軍文 dengjunwen69@126.com】