日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優化＊

楊慧霞，陳欣雨，楊晨娜，杜靈潔，胡秀榮，邊才苗

（臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種發生于老年和老年前期以進行性神經退化為特征的退行性疾病，臨床上有記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙，以及人格和行為改變等全面性癡呆表現，最終可導致死亡［1-2］。隨著人口老齡化的出現，AD疾病已成為諸多學者關注的第四大疾病。研究表明AD是一種多病因疾病，臨床上主要依據為“膽堿能缺失學說”［3］，認為大腦內神經遞質-乙酰膽堿的缺失是導致AD疾病的關鍵原因。乙酰膽堿酯酶（AChE）催化乙酰膽堿的裂解反應，導致乙酰膽堿的缺失、神經信號傳遞失敗。目前對AD的藥物治療多采用膽堿酯酶抑制劑（AChE I）抑制AChE活性，以延緩乙酰膽堿的水解速度［4］。

諸多植物的藥用成分對AD具有療效好、副作用小、作用面廣、適宜長期服用等優點。因而從藥用植物中尋找具有抗老年性癡呆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，已成為當今醫藥研究方面的熱點課題［5-9］。植物來源的天然產物中有AChE抑制活性的生物堿種類豐富，主要包括甾體類、三萜類、石松堿類、異喹啉類和吲哚類生物堿［8，9］。

日本莢蒾（Viburnum japonicum）為忍冬科（Caprifoliaceae）莢蒾屬植物，主要生長在海島低海拔雜木林中，為常綠的灌木或小喬木。日本莢蒾在日本和中國呈間斷分布，在中國大陸分布范圍十分狹窄，僅見于浙江省臺州市椒江區的上大陳島，臨海市的頭門島、雀兒岙等海島，以及舟山東福山島（圖1），目前數量稀少，屬浙江省首批重點保護野生植物［10］。莢蒾屬植物所含的物質成分復雜，具有抗氧化、止咳化痰、消炎抗菌、治療月經不調、胃腎絞痛等功效［11］。預實驗結果表明，日本莢蒾葉片和果實中含有乙酰膽堿酯酶抑制劑。為此，本文以日本莢蒾的成熟葉片為材料，測定了其提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制率，并對乙酰膽堿酯酶抑制劑的提取工藝進行了優化。

圖1 日本莢蒾、日本莢蒾分布區域、我國日本莢蒾分布區域

1 材料與方法

1.1 材料來源

日本莢蒾成熟葉片，采摘于浙江省臺州學院臨海校區珍稀植物種植園，采摘時間為2017年11月下旬，清水沖洗后，經真空冷凍干燥、研碎后，置于密閉的玻璃瓶內4℃保存，備用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同溶劑提取液的制備

在三個錐形瓶中各加入10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，分別加入水、甲醇和80%的乙醇100 mL，混勻后60℃回流提取2 h，過濾；將濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存備用。

使用前將浸膏用50%乙醇配制成1.0 mg/mL的稀釋液，按照乙酰膽堿酯酶試劑盒說明書測定乙酰膽堿酯酶抑制率，其中提取物的稀釋液作為抑制劑使用。

計算公式［12，13］：抑制率=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）

1.2.2 不同乙醇濃度提取液對乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，分別與100 mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液混合，在60℃回流提取2 h，過濾；將濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存備用。隨后的處理和測定同1.2.1。

1.2.3 不同溫度提取對AChE抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，與100 mL 80%乙醇溶液混合，分別在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃條件下回流提取2 h，過濾；將濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存備用。隨后的處理和測定同1.2.1。

1.2.4 不同時間提取對AChE抑制率的影響

取5份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，與100 mL 80%乙醇溶液混合，在60℃條件下分別回流提取60、90、120、150和180 min，過濾；將濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存備用。隨后的處理和測定同1.2.1。

1.2.5 粗提物的萃取處理

取3份10.0 g研碎的日本莢蒾葉片樣品，按照優化的提取程序制備粗提液，濾液用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，將所得浸膏加入20 mL蒸餾水，再分別加入30 mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每份各萃取3次，合并3次萃取液，經旋轉蒸發儀濃縮成浸膏，真空干燥后4℃保存備用。隨后的處理和測定同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取液的AChE抑制率

不同溶劑提取液對AChE的抑制率見表1，結果顯示，用乙醇作為提取溶劑時，提取液對AChE的抑制率最高，甲醇提取液的抑制率其次，水提取液的抑制率很低，三者的差異均為極顯著（p＜0.01），可選擇乙醇作為提取溶劑。

表1 不同溶劑的提取液對AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

2.2 不同乙醇濃度提取液對AChE抑制率的影響

不同乙醇濃度的日本莢蒾葉片提取液對AChE的抑制率見圖2。結果顯示，乙醇濃度80%時，提取液對AChE的抑制率最高；乙醇濃度60%～90%時，提取液的抑制率差異不顯著；乙醇濃度為50%時，提取液的抑制率最低，與乙醇濃度為80%時的差異顯著（p＜0.05）。

圖2 不同乙醇濃度提取液的AChE抑制率

2.3 不同提取溫度提取液對AChE抑制率的影響

不同提取溫度下，日本莢蒾葉片提取液對AChE的抑制率見圖3。結果顯示，在提取溫度60℃時，提取液對AChE的抑制率最高；提取溫度為50～70℃時，抑制率差異不顯著；而提取溫度為40℃時和80℃時的抑制率均較低，與提取溫度為60℃時的差異顯著（p＜0.05）。

圖3 不同提取溫度提取液的AChE抑制率

2.4 不同提取時間提取液對AChE抑制率的影響

不同提取時間下，日本莢蒾葉片提取液對AChE的抑制率見圖4。結果顯示，在提取時間120 min時，提取液對AChE的抑制率最高；提取時間為90～180 min時，提取液的抑制率之間差異不顯著（p＞0.05）；而提取時間為60 min時抑制率最低，與提取時間為120、150和180 min時的抑制率差異均為顯著（p＜0.05）。

圖4 不同提取時間提取液的AChE抑制率

綜合2.2～2.4的實驗結果，日本莢蒾葉片中AChE抑制物回流提取的最佳工藝是：提取溶劑為80%乙醇、提取溫度為60℃、提取時間為120 min。

2.5 不同有機溶劑萃取組分對AChE抑制率的影響

不同有機溶劑萃取組分對AChE的抑制率見表2。結果顯示，石油醚萃取相的抑制率最高，乙酸乙酯萃取相的其次，兩者均高于對照（未萃取的提取液），其中石油醚萃取相與對照的差異為顯著（p＜0.05）；正丁醇萃取相的抑制率較低，與其他2種萃取相和對照的抑制率差異均為極顯著（p＜0.01）。提示從石油醚相和乙酸乙酯相中有可能存在活性更強的AChE抑制成分。

表2 不同有機溶劑萃取組分對AChE的抑制率（1.0 mg/mL）

3 討論與結論

隨著社會人口的老化，AD癥的發病率相對增高。目前，全世界約有1700萬以上人患有此癥［12］。因此，有必要從植物中提取和純化出高效的AChE抑制物。本文的研究表明，日本莢蒾葉片中有豐富的AchE抑制物，用乙醇提取效果較好，最適提取條件為：乙醇濃度80%、提取溫度60℃、提取時間120 min。再者，比較不同溶劑萃取組分的抑制率，顯示石油醚相和乙酸乙酯相的抑制率較高，顯著高于未萃取的對照；而正丁醇相的抑制率相對較低。提示對AChE具抑制作用的有效成分可能是低極性的。已有文獻［12-14］報道，含氧低、極性小的萜類、甾體，生物堿等對AchE有抑制活性。因此，從石油醚相和乙酸乙酯相中很可能存在活性更強的有效成分，有利于AD癥高效防治藥物的開發。