8個稻瘟病抗性基因在三系雜交粳稻親本中的分布

儲黃偉，程 燦，牛付安，周繼華，涂榮劍，羅忠永，王新其，曹黎明

（上海市農業科學院作物育種栽培研究所，上海201403）

水稻是我國最主要的糧食作物，有超過65%的人口以水稻為主糧。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一。稻瘟病的爆發，會嚴重影響水稻的產量，甚至導致部分病害嚴重區域絕收［1］。在所有的稻瘟病防治措施中，稻瘟病抗病品系的培育和種植被認為是最有效、經濟和安全的控制該病害的措施［2-3］。

傳統的稻瘟病抗性育種，依賴于雜交和表型的選擇，存在育種周期長，工作量大，準確率低等問題。近年來，隨著分子生物學的發展，利用和已知稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記進行分子標記輔助育種，逐漸成為稻瘟病抗性育種的主要手段。目前，至少已報道了70個稻瘟病抗性位點共85個主效基因［4］。在這些稻瘟病主效抗性基因中，已經有 Pb1、Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56、Pi63和 PiCO39等 24個基因被成功地克?。▏宜緮祿行?，稻瘟病主效抗性基因列表http：//www.ricedata.cn/gene/gene＿pi.htm）。根據已經克隆的稻瘟病抗性基因與其感病等位基因之間的序列差異而設計的功能性標記，可以不用費時費力地接菌鑒定，而準確和快速地檢測到水稻品系抗稻瘟病基因的存在［5］，這為鑒定攜帶稻瘟病抗性基因的種質資源以及開展抗稻瘟病的聚合育種帶來了新的契機。

在上海地區，每年的水稻種植面積大約在10萬hm2左右，在這其中雜交粳稻的面積大約占1/3左右。然而，對于目前在上海地區使用的雜交粳稻骨干親本中稻瘟病抗性基因的基因型，還沒有進行鑒定。本研究利用 Pi2［6-8］、Pi5［6，9］、Pi9［6，10］、Pi54［11-13］、Pia［14-15］、Pib［16-18］、Pit［5］、Pita［6，19］等 8個稻瘟病抗性基因的功能性標記，分析這8個抗稻瘟病基因在36份恢復系和42份不育系中的分布，以期為配制攜帶有不同稻瘟病抗性基因的雜交水稻組合，以及利用標記輔助選擇聚合多個稻瘟病抗性基因品系的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 水稻品系

供試的36份恢復系和42份不育系材料（表1）均來自上海市農業科學院作物育種栽培研究所水稻雜種優勢利用課題組，是課題組選育雜交粳稻的骨干親本。

表1 水稻品系中稻瘟病抗性基因的基因型檢測Table 1 Genotypic detection of blast-resistant genes in rice lines

1.2 水稻DNA提取

每個水稻品系取50 mg左右葉片，用剪刀剪碎，放入2 mL離心管，加入600μL 1.5×CTAB溶液（1.5%CTAB，75 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L EDTA，1.05 mol/L NaCl，pH 8.0）和1粒直徑5 mm的鋼珠，在快速研磨儀上70 Hz的頻率震蕩研磨90 s；研磨后的樣品在56℃水浴鍋中溫浴20 min，加入450μL氯仿，劇烈震蕩后，12 000 r/min離心10 min；取450μL上清液到另一個1.5 mL的離心管中，加入900μL的無水乙醇，混勻后在－20℃冰箱放置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，晾干后加入200μL的雙蒸水溶解DNA，置于－20℃冰箱備用。

1.3 稻瘟病抗性基因的檢測

本研究檢測 Pi2［6-7］、Pi5［6，9］、Pi9［6，10］、Pi54［11-13］、Pia［14-15］、Pib［16-18］、Pit［5］、Pita［6，19］等 8個稻瘟病抗性基因，其功能性分子標記的引物信息見表2。PCR擴增以及產物檢測的方法參照表2中相應的文獻。

表2 PCR擴增所用的引物Table 2 Primers used for PCR amplification

1.4 數據統計分析

根據PCR產物的電泳檢測結果，檢出稻瘟病抗性等位基因記為1，檢出感病等位基因記為0。然后利用NTsys 2.1e軟件中的SHAN子集的UPGMA方法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因的檢測

檢測了36個恢復系和42個不育系中Pi2、Pi5、Pi9、Pi54、Pia、Pib、Pit和Pita等8個稻瘟病抗性基因的基因型（表1）。結果表明：Pib稻瘟病抗性基因在本研究檢測的水稻品系中分布最為廣泛，在54個（28個不育系和26個恢復系）品系中檢測到了抗性基因的存在；其次從高到低依次為Pia、Pia54、Pi9、Pi2和Pita，分別在45個（15個不育系和30個恢復系）、33個（11個不育系和22個恢復系）、24個（12個不育系和12個恢復系）、23個（15個不育系和8個恢復系）和20個（18個不育系和2個恢復系）品系中檢測到；而Pi5和Pit是在本研究檢測的水稻品系中出現頻率最低的稻瘟病抗性基因，分別只在5個品系中檢測到，其中Pi5抗性基因在1個不育系和4個恢復系中，而含有Pit抗性基因的5個品系都是不育系（圖1）。

圖1 稻瘟病抗性等位基因在檢測水稻品系中的分布頻率Fig.1 Frequency distribution of blast-resistant genes in rice lines

在所有檢測的78個水稻品系中，在8527A、徐1A和016A等3個品系中未檢測到稻瘟病抗性基因的存在，而含有稻瘟病抗性基因最多品系申11A含有6個抗性基因，其余含有1—5個抗性基因的分別有10個、25個、18個、19個和2個水稻品系（圖2）。

圖2 稻瘟病抗性等位基因數目在檢測水稻品系中的分布頻率Fig.2 Frequency distribution of blast-resistant gene numbers in rice lines

2.2 遺傳差異聚類分析

根據8個稻瘟病抗性基因的基因型特征，對78個水稻品系進行聚類分析。結果表明：檢測的水稻品系間遺傳相似系數的變化范圍為0.55—1，在相關系數大于0.67的水平上，可以將78個水稻品系分為5組，其中組Ⅰ包含31個品系，組Ⅱ包含4個品系，組Ⅲ包含20個品系，組Ⅳ包含13個品系，組Ⅴ包含10個品系（圖3）。

圖3 78個水稻品系遺傳差異聚類分析Fig.3 Genetic distance-based cluster analysis of 78 rice lines

3 討論

在目前已經報道的85個稻瘟病抗性主效基因中，除了Pi21［20］和 Pi55［21］兩個是隱性基因，其他的稻瘟病抗性等位基因都是顯性的（國家水稻數據中心，稻瘟病主效抗性基因列表http：//www.ricedata.cn/gene/gene＿pi.htm）。解釋雜種優勢形成機理的“顯性假說”認為在等位基因中多數顯性基因是有利的，相對的隱性基因是不利的。在雜交后代中來自一個親本的顯性等位基因可以掩蓋來自另一個親本的隱性等位基因，使得在雜交后代中具有比單個親本更多的有利顯性基因，從而使雜合后代表現出更好的生長、抗逆和抗病等等性狀［22-23］。根據本研究稻瘟病抗性基因的鑒定和遺傳差異的聚類分析結果，在配制雜交組合親本選擇的過程中，可以按照稻瘟病抗性基因的互補及遠緣雜交優勢的原則進行。根據這一原則，用不育系申9A分別與恢復系申繁24號和申繁26號配制了2個雜交組合申優415和申優26。在遺傳差異的聚類分析結果中，申9A、申繁24號和申繁26號分別屬于組Ⅴ、組Ⅰ和組Ⅲ，申9A含有P i2、Pib和Pita等3個抗性基因，申繁24號含有Pi9、Pi54、Pia和Pib等4個抗性基因，而申繁26號含有Pi9、Pi54和Pia等3個抗性基因，這樣就使得雜交組合申優415和申優26都含有了Pi2、Pi9、Pi54、Pia、Pib和Pita等6個稻瘟病抗性基因。在這6個基因中，Pi2和Pi9是同一個基因位點上的復等位基因［24］。Pi2對稻瘟病的抗譜相當廣，將攜帶Pi2的親本C101A51接種從華東、華南和西南12個省區收集來的792個稻瘟病小種，對其中92.45%的小種表現出抗性［25］，此外Pi2還對來自13個國家的43個稻瘟病菌株中的36個表現抗性［24］；Pi9的抗性同樣很廣，對來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現出很高的抗性［24］；Pia抗性基因的抗譜較窄，對來自于中國10個省區的稻瘟病群體接種鑒定，僅對來自江蘇的稻瘟病群體表現出較強的抗［15］；Pib基因對來自日本的大多數稻瘟病小種以及中國的菌株ZB13和ZC15表現出較好的抗性［16］；Pi54是一個廣譜的稻瘟病抗性基因，對來自印度的大多數稻瘟病小種表現出抗性［13］；Pita對稻瘟病菌菌株ZN57（IC-17）和ZN61（IB-49）表現出較好的抗性［26］。通過親本的選擇，使最終用于生產的雜交組合申優415和申優26中都含有了6個稻瘟病抗性主效基因，保證了這2個組合具有了比較廣譜的稻瘟病抗性，這2個組合在上海及周邊地區生產試驗中表現出較強的稻瘟病抗性。

本研究檢測的8個稻瘟病抗性基因中，Pi5和Pit這2個基因的分布較少，Pi5在4個恢復系和1個不育系中存在，而Pit只在5個不育系中檢測到。對于這類基因，可以應用分子標記輔助選擇的手段轉入到更多的水稻品系中。

檢測結果還發現8527A、徐1A和016A等3個不育系中不含本研究中檢測的8個稻瘟病抗性基因中的任何一個，另外還有10個品系中只檢測到了一個稻瘟病抗性基因。在應用這類水稻品系配制雜交組合時，應盡量選擇與含有多個稻瘟病抗性基因的品系進行配組。然而在雜交水稻制種的過程中，選用這類稻瘟病抗性較差的品系作為親本，存在著一定的風險，今后將考慮應用標記輔助選擇的手段，將稻瘟病抗性基因引入這些品系。

目前已知的稻瘟病主效抗性基因已經有85個，已經克隆的也有24個，而本研究中只檢測了8個稻瘟病抗性基因。在今后的工作實踐中，有必要去檢測更多的稻瘟病抗性基因在本課題組核心種質資源中的分布，為雜交組合的配制及分子標記輔助選擇育種提供理論基礎。

［1］OU SH.Rice diseases［M］.Kew，UK：Commonwealth Mycological Institute，1985.

［2］FUKUOKA S，SAKA N，KOGA H，et al.Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice［J］.Science，2009，325（5943）：998-1001.

［3］JEUNG JU，KIM B R，CHO Y C，et al.A novel gene，Pi40（t），linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifs confers broad spectrum of blast resistance in rice［J］.Theor Appl Genet，2007，115（8）：1163-1177.

［4］ZHENGW，WANG Y，WANG L，etal.Geneticmapping andmolecularmarker development for Pi65（t），a novel broad-spectrum resistance gene to rice blast using next-generation sequencing［J］.Theor Appl Genet，2016，129（5）：1035-1044.

［5］HAYASHIK，YASUDA N，FUJITA Y，et al.Identification of the blast resistance gene Pit in rice cultivars using functionalmarkers［J］.Theor Appl Genet，2010，121（7）：1357-1367.

［6］高利軍，高漢亮，顏群，等.4個抗稻瘟病基因分子標記的建立及在水稻親本中的分布［J］.雜交水稻，2010（S1）：294-298.

［7］ZHOU B，QU S，LIU G，et al.The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea［J］.Mol Plant Microbe Interact，2006，19（11）：1216-1228.

［8］YU Z H，MACKILL D J，BONMAN JM，et al.Tagging genes for blast resistance in rice via linkage to RFLPmarkers［J］.Theor Appl Genet，1991，81（4）：471-476.

［9］LEE SK，SONG M Y，SEO Y S，et al.Rice Pi5-mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiled-coil-nucleotidebinding-leucine-rich repeat genes［J］.Genetics，2009，181（4）：1627-1638.

［10］QU S，LIU G，ZHOU B，et al.The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is amember of amultigene family in rice［J］.Genetics，2006，172（3）：1901-1914.

［11］RAMKUMAR G，SRINIVASARAO K，MOHAN KM，etal.Developmentand validation of functionalmarker targeting an InDel in themajor rice blast disease resistance gene Pi54（Pik h）［J］.Molecular Breeding，2011，27（1）：129-135.

［12］SHARMA TR，RAIA K，GUPTA SK，et al.Broad-spectrum blast resistance gene Pi-k h cloned from rice line tetep designated as Pi54［J］.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2010，19（1）：87-89.

［13］SHARMA T R，MADHAV M S，SINGH B K，et al.High-resolution mapping，cloning and molecular characterization of the Pi-k h gene of rice，which confers resistance to Magnaporthe grisea［J］.Molecular Genetics and Genomics，2005，274（6）：569-578.

［14］潘慶華，潘金媚，張玉，等.稻瘟病抗性基因Pia-C功能特異性分子標記及其方法與應用：CN102676512A［P/OL］.2012-09-19［2016-12-12］.http：//d.g.wanfangdata.com.cn/Patent＿CN201210164522.6.aspx.

［15］曾曉珊，楊先鋒，趙正洪，等.稻瘟病抗病基因Pia的抗性分析及精細定位［J］.中國科學：生命科學，2011，41（1）：70-77.

［16］劉洋，徐培洲，張紅宇，等.水稻抗稻瘟病Pib基因的分子標記輔助選擇與應用［J］.中國農業科學，2008，41（1）：9-14.

［17］WANG Z X，YANOM，YAMANOUCHIU，etal.The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes［J］.Plant J，1999，19（1）：55-64.

［18］FJELLSTROM R，CONAWAY-BORMANSC A，MCCLUNG A M，et al.Development of DNA markers suitable formarker assisted selection of three Pi genes conferring resistance tomultiple Pyricularia grisea pathotypes［J］.Crop Science，2004，44（5）：1790-1798.

［19］JIA Y，JIA Y，WANG Z，et al.Development of dominant rice blast Pi-ta resistance genemarkers［J］.Crop Sci.，2002，42（6）：2145-2149.

［20］FUKUOKA S，OKUNO K.QTL analysis and mapping of pi21，a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2）：185-190.

［21］何秀英，劉新瓊，王麗，等.稻瘟病新隱性抗病基因 pi55（t）的遺傳及定位［J］.中國科學：生命科學，2012，42（2）：125-141.

［22］DAVENPORTC B.Degeneration，albinism and inbreeding［J］.Science，1908，28（718）：454-455.

［23］BRUCE A B.The Mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor［J］.Science，1910，32（827）：627-728.

［24］LIU G，LU G，ZENG L，et al.Two broad-spectrum blast resistance genes，Pi9（t）and Pi2（t），are physically linked on rice chromosome 6［J］.Molecular Genetics and Genomics，2002，267（4）：472-480.

［25］CHEN H L，CHEN B T，ZHANG D P，et al.Pathotypes of Pyricularia grisea in rice fields of central and southern China［J］.Plant Disease，2001，85（8）：843-850.

［26］王忠華，賈育林，吳殿星，等.水稻抗稻瘟病基因 Pi-ta的分子標記輔助選擇［J］.作物學報，2004，30（12）：1259-1265.