基于SRK基因序列分析的甘藍自交不親和系單倍型鑒定及驗證

鄭 敏 朱陳曾 劉夢慈 徐冰冰 馬存發 李勤菲 任雪松 司 軍 宋洪元

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，重慶 400715）

甘藍（Brassica oleraceaL. var.capitataL.）為十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，由不結球的野生甘藍經長期栽培演化而來，是世界各地廣泛栽培的蔬菜種類之一。甘藍作為典型的異花授粉作物，具有花期自交不親和的特性，屬于孢子體自交不親和性植物（sporophytic SI，SSI）（Tantikanjana et al.，2010）。自交不親和系在遺傳上由多個復等位基因高度多態性的S位點控制（Takasaki et al.，2000）。S位點基因通常以一個單位遺傳給后代，幾乎不會發生重組現象，因此S等位基因又稱作S單倍型。目前，已經分離到3類與該位點連鎖的基因：SRK受體激酶基因（S-locus receptor kinase）（Nasrallah et al.，1985）、SLG糖蛋白基因（S-locus glycoprotein）（Stein et al.，1991）、SCR（S 富 含 半胱氨酸蛋白基因，S-locus cysteine rich）/SP11（S蛋白 11基因，S-locus protein11）（Schopfer et al.，1999）。SLG基因和SRK基因在雌蕊柱頭中表達，SCR/SP11基因在雄蕊花藥中表達，這3個基因緊密連鎖，在花粉、柱頭識別過程中起重要作用（Kusaba et al.，2000；Takasaki et al.，2000； 盧軍 等，2007），其中SRK基因與SLG基因均呈高度多態性，同一S等位基因系中的SLG基因與SRK基因在序列上協同進化，因此將這兩個基因及其連鎖序列合稱為一種S單倍型（S-haplotype）（Boyes & Nasrallah，1993；Okamoto et al.，2004）。迄今，蕓薹屬中已有逾100個S單倍型被確定，在甘藍中已經找到了逾50個S單倍型（Ockendon，2000）。不同S單倍型自交不親和系之間花期授粉能正常結籽，相同S單倍型之間花期授粉不能結籽或結籽率極低。因此，利用不同單倍型的自交不親和系進行雜種一代配制是目前甘藍雜種優勢利用的重要途徑之一。

目前，甘藍育種家通過連續自交、小孢子培養等途徑育成大量的自交不親和系，這些在球形、熟性、抗病性等農藝性狀表型不同的自交不親和系存在相同的S單倍型情況。在育種實踐中，不同自交不親和系之間雜交組合配制時除了進行蕾期徹底去雄外，還需同時進行花期雜交，確認參與配組的兩個自交不親和系是否屬于同一個單倍型。該方式在一定程度上降低了雜交組合設計的針對性，且田間工作量大。因此，在甘藍雜交育種工作中進行不同自交不親和系的單倍型鑒定和分析是非常重要的。早期的自交不親和系單倍型鑒定和分析方法，如花期親和指數法（方智遠 等，1983）、熒光顯微法（張恩慧，1989；陳世儒 等，1990）、免疫測定 法（Kandasamy et al.，1989；Chen & Nasrallah，1990）、等電聚焦電泳法（Nishio & Hinata，1978）等方法存在易受環境條件影響、操作過程繁瑣復雜、應用難度較大等問題（高啟國 等，2011）；基于DNA分子的PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，限制性片段長度多態性－聚合酶鏈式反應）鑒定法受酶切片段多態性的限制難以準確進行多個單倍型的區分（Nasrallah & Nasrallah，1989；朱利泉和王小佳，2000；張愛芬 等，2008）；根據SRK激酶區序列設計ClassⅠ型以及ClassⅡ型引物僅能將不同自交不親和系分為ClassⅠ型和ClassⅡ型，無法確定相應的S單倍型（田磊 等，2011）。隨著蕓薹屬植物自交不親和性研究的深入，包括甘藍在內的大量S單倍型所含的SLG、SRK和SCR基因序列的確定以及DNA測序技術的飛速發展，結合生物信息學分析，使得在基因序列水平上快速鑒定蕓薹屬自交不親和S單倍型成為可能（李霞 等，2015）。根據SRK基因序列比對，甘藍自交系所屬S單倍型（高啟國 等，2011；田磊 等，2011；Tian et al.，2013）以及一代雜種所屬的S單倍型可被確定（苗雯雯 等，2013）。然而，基于SRK基因序列分析的單倍型鑒定法是否與傳統的花粉管萌發熒光鑒定法、花期親和指數鑒定法具有一致性仍缺少相應的報道。

本試驗針對自交不親和雌蕊決定因子SRK基因設計簡并引物，對23個穩定的甘藍自交不親和系SRK基因進行PCR擴增、克隆測序，獲得的SRK基因序列進行NCBI數據庫的比對分析以及相互之間的序列比較分析，確定相應自交不親和系的單倍型；并在此基礎上進行相同單倍型之間、不同單倍型之間花期雜交的熒光顯微法鑒定以及花期親和指數鑒定，以期驗證基于SRK基因序列分析可否快速確定相應甘藍自交不親和系所屬單倍型，從而實現有計劃地設計甘藍雜交組合，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為23份穩定的甘藍自交不親和系（表1），均由西南大學十字花科蔬菜研究所保存提供。2016年7月育苗，8月定植于西南大學十字花科蔬菜研究所歇馬基地。

表1 參試甘藍自交不親和系來源及特征特性

1.2 甘藍基因組DNA的提取

分別取甘藍自交不親和系植株幼嫩葉片，利用改良的CTAB法（王關林 等，2014）提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，電泳條帶單一且分光光度計檢測D260/D280比值在1.8～2.0范圍內的DNA樣品為合格樣品，置于-20℃冰箱備用。

1.3 SRK基因引物設計及PCR擴增

根據甘藍SRK基因序列保守區域設計簡并引物：SRK-F：5′-TCAAVCAAYAGAACACTT-3′和SRK-R：5′-CTTYATCCTKGTAAAACCAT-3′（引物中V=A/C/G、Y=C/T、K=G/T），由北京六合華大基因科技有限公司合成。利用該簡并引物，以23份甘藍自交不親和系DNA為模板，擴增SRK基因片段。PCR擴增體系（25 μL）：10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL，上下游引物（50 μmol·L-1）各 0.1 μL，TaqDNA polymerase（5 U·μL-1）0.2 μL， 模 板 DNA 1.0 μL，ddH2O補齊25 μL。PCR反應程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃7 min。獲得預期大小的PCR產物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像儀系統進行拍照。

1.4 目的片段的回收、克隆及測序分析

利用OMEGA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收目的片段，連接到TRKARA公司的pMD?19-T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，將獲得的克隆進行PCR鑒定。鑒定后的陽性克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。每份自交不親和系的SRK基因片段測定2～3個克隆。

1.5 甘藍自交不親和系S單倍型的確定

將獲得的各自交不親和系的SRK基因序列在NCBI數據庫進行Blast比對，確定相應的單倍型。在此基礎上利用在線軟件Multialin進行相同單倍型以及不同單倍型之間的SRK序列比較分析。根據Tian等（2013）的報道，設計PK1/PK4和KD4/KD7兩對引物，進一步對23份自交不親和系的單倍型（ClassⅠ型、ClassⅡ型）進行鑒定。

1.6 單倍型的驗證分析

2017年4月，在西南大學園藝園林學院甘藍育種基地，根據不同甘藍自交不親和系SRK基因序列比較確定的S單倍型，設計20個雜交組合，含相同單倍型、不同單倍型甘藍自交不親和系之間的花期、蕾期雜交授粉，并以各自交不親和系花期和蕾期自交授粉為對照，3次重復，每重復至少50朵花/蕾。

1.6.1 花粉原位萌發的熒光顯微鏡觀察 不同甘藍自交不親和系之間花期和蕾期授粉3～5 h后，取其柱頭于固定液（冰乙酸∶無水乙醇=9V∶1V的混合液）中固定，24 h后轉移至70%的乙醇中保存。固定后的柱頭在2 mol·L-1NaOH溶液中55 ℃軟化至透明（約2 h），再用50 mmol·L-1偏磷酸鉀溶液清洗3～5次，置于0.1%苯胺藍染液中染色2 h，取出柱頭并用50%甘油壓片于Leica DM6000B熒光顯微鏡380 nm激發光下進行花粉管萌發情況觀察。每個組合調查至少3個柱頭。

1.6.2 親和指數的測定 完成全部授粉后統計授粉的花朵數，待種莢成熟后逐一考種，計算花期和蕾期雜交親和指數。3次生物學重復，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

親和指數=種子數/授粉的花朵數

2 結果與分析

2.1 SRK基因的PCR擴增

利用SRK基因簡并引物SRK-F和SRK-R，分別從23份甘藍自交不親和系中擴增出預期約

1.0 kb大小的目的片段（圖1）。目的片段進行回收，克隆于pMD?19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，對PCR鑒定呈陽性的克隆進行測序分析。

圖1 23份甘藍自交不親和系SRK基因片段的PCR擴增產物

2.2 甘藍自交不親和系單倍型的確定

從表2可以看出，23份甘藍自交不親和系的SRK序列均在NCBI庫中找到對應的單倍型，其序列一致性在95%～99%之間。如自交不親和系E3的SRK基因對應NCBI中已知的SRK36單倍型，其序列覆蓋率達到99%，序列相似度達到98%，因此將甘藍自交不親和系E3確定為SRK36單倍型。其他的自交不親和系單倍型的確定按類似的方法進行，23份甘藍自交不親和系分屬10個不同的單倍型，其中屬于SRK36單倍型的有5份，占參試甘藍自交不親和系的22%；SRK7、SRK16和SRK583種單倍型均只在1份材料中發現。

將屬于相同S單倍型的自交不親和系SRK基因序列以及分屬于不同S單倍型的自交不親和系SRK基因序列進行比較。結果表明：屬于同一S單倍型（SRK36）的5個自交不親和系（282、K1、G1、P1、E3）SRK基因序列同源性極高，僅個別堿基存在差異或個別自交不親和系發生片段缺失現象，如G1材料的SRK36缺失45 b p序列（圖2-a）；而分屬不同S單倍型自交不親和系F416（SRK3）、B1（SRK28）、P1（SRK36）、H2（SRK45） 的SRK基因序列差異較大（圖2-b）。

進一步針對23份甘藍自交不親和系所屬的ClassⅠ型以及ClassⅡ型自交不親性進行鑒定，其中PK1/PK4引物在23份甘藍自交不親和系中均擴增獲得大小為950 bp的條帶，KD4/KD7引物在7 份材料（B3、G1、H2、K1、282、301、339）中擴增獲得大小為1 100 bp的條帶（圖3）。說明除B3、G1、H2、K1、282、301、339外的其他材料屬于ClassⅠ型自交不親和，而7份含1 100 bp條帶的材料屬于ClassⅠ型和ClassⅡ型雜合材料。

表2 不同甘藍自交不親和系所屬單倍型

圖2 相同單倍型SRK基因序列以及不同單倍型SRK基因序列的多重 比較

2.3 單倍型的驗證分析

2.3.1 花粉原位萌發的熒光顯微觀察 蕓薹屬作物自交不親和性表現為開花后自花花粉或相同S單倍型花粉在其柱頭上萌發受阻或雖然萌發但花粉管不能正常伸長穿過柱頭完成受精。如甘藍自交不親和系F416（SRK3單倍型）花期自交授粉后可明顯看到花粉粒被吸附在柱頭表面但是未形成花粉管束穿過柱頭乳突細胞（圖4-a），但其蕾期自交授粉后可觀察到大量花粉在柱頭表面萌發且有部分形成花粉管穿過柱頭乳突細胞（圖4-b）。相同S單倍型自交不親和系花期雜交授粉，如F416（SRK3）×H1（SRK3）、G1（SRK36）×P1（SRK36）可見大量花粉被吸附在柱頭表面，但是幾乎看不到萌發的花粉形成花粉管穿過柱頭乳突細胞（圖4-c、d）。然而，屬于不同S單倍型的自交不親和系花期雜交授粉后，如F416（SRK3）×E3（SRK36）、H1（SRK3）×H2（SRK45）則可以觀察到大量的花粉被吸附在柱頭表面萌發并形成花粉管穿過柱頭乳突細胞進入花柱組織（圖4-e、f）。上述花粉管萌發的熒光檢測結果支持了根據SRK序列所確定的不同甘藍自交不親和性的單倍型劃分結果。

圖3 23份甘藍自交不親和系ClassⅠ型以及ClassⅡ型自交不親性鑒定

圖4 相同S單倍型以及不同S單倍型甘藍自交不親和系花期雜交花粉原位萌發熒光顯微觀察結果

2.3.2 相同S單倍型以及不同S單倍型甘藍自交不親和系花期雜交結莢結籽情況 田間花期授粉35 d后，F416花期自交授粉結莢結籽情況（圖5-a～c）與 相 同 S單 倍 型 G1（SRK36）×P1（SRK36）、F416（SRK3）×H1（SRK3）自交不親和系花期雜交授粉后結莢結籽情況一致，表現為所結種莢短小、干癟，幾乎看不見籽粒突起，空莢占大多數且掉莢現象較為普遍（圖5-g～l）。而不同S單倍型F416（SRK3）×E3（SRK36）、H1（SRK3）×H2（SRK45）自交不親 和系花期雜交授粉后所結種莢長、飽滿，籽粒突起明顯且種子發育飽滿，空莢、死莢極少（圖5-m～r），最多種莢結籽數達到34粒，且結籽數量明顯優于各S單倍型蕾期自交授粉結莢結籽情況（圖5-d～f）。上述結果表明，根據SRK基因序列確定的相同S單倍型自交不親和系之間花期授粉后不能結籽，表現不親和；而不同S單倍型自交不親和系之間花期授粉后結籽量多且飽滿，親和性高。

2.3.3 相同S單倍型以及不同S單倍型甘藍自交不親和系雜交組合的花期親和指數 一般認為，花期親和指數小于0.5或1的材料屬于強自交不親和系；介于1～3之間為弱自交不親和系；而大于10的被認定為自交親和系（方智遠 等，1983）。從表3可以看出，自交不親和系F416花期自交雜交親和指數為0.09，而蕾期自交平均親和指數為1.73，屬于嚴格的自交不親和系。20個雜交組合中，相同S單倍型自交不親 和系共配制8個雜交組合， 花期雜交親和指數均小于0.5，其中E3（SRK36）×G1（SRK36）親和指數最高，但也僅為0.26；且相同S單倍型自交不親和系之間花期正反交不影響其親和指數，如E3（SRK36）和G1（SRK36）正反交親和指數無顯著差異。而分屬12個不同S單倍型自交不親和系之間花期雜交結籽多，親和指數高，最低親和指數為8.10〔E3（SRK36）×H1（SRK3）〕，最高親和指數達到21.76〔F1（SRK7）×E3（SRK36）〕。 另 外， 不同S單倍型自交不親和系之間花期雜交親和指數差異較大，如H1（SRK3）作為母本分別與H2（SRK45）、E3（SRK36）雜交時，花期親和指數差異不顯著；但E3（SRK36）作為母本分別與H1（SRK3）、F1（SRK7）、N1（SRK8） 雜 交 時，E3（SRK36）×H1（SRK3）的親和指數顯著低于另外兩個組合；F1（SRK7）作為母本分別與H2（SRK45）、E3（SRK36）雜交時，親和指數差異達顯著水平。同一自交不親和系作為母 本與不同單倍型材料雜交后出現結籽數量差異大的現象，可能與來自父本中花粉決定因子SCR/SP11的親和性有關。上述結果顯示，根據SRK基因序列確定的相同S單倍型自 交不親和系之間花期雜交確實不親和，而不同S單倍型自交不親和系之間的花期雜交是親和的，表明基于SRK基因序列分析確定單倍型可以用于指導不同甘藍自交不親和系的雜交組合設計。

圖5 相同S單倍型以及不同S單倍型甘藍自交不親和系花期雜交結莢結籽情況

表3 不同甘藍自交不親和系雜交組合的花期親和指數

3 結論與討論

蕓薹屬自交不親和性可分為ClassⅠ型和ClassⅡ型兩大類，其中ClassⅠ型為花粉顯性，表現強自交不親和；ClassⅡ型為花粉隱性，表現弱自交不親和（Nasrallah & Nasrallah，1993）。利用SRK基因特異引物，Tian等（2013）對111份結球甘藍自交系的單倍型進行鑒定，發現56份屬于ClassⅠ型（PK1/PK4引物對），55份屬于ClassⅡ型（KD4/KD7引物對）；然而，基于花粉管熒光染色鑒定，僅4份屬于SRK15單倍型的ClassⅡ型材料表現為花期親和。在甘藍育種中，兩種類型自交不親和系均被廣泛用于雜種配制（苗雯雯 等，2013）。本試驗中，PK1/PK4引物在23份甘藍自交不親和系中均擴增獲得大小為950 bp的條帶，KD4/KD7引物在7份材料（B3、G1、H2、K1、282、301、339）中擴增獲得大小為1 100 bp的條帶，顯示這7份材料在S位點上是雜合的，屬于雜合體。甘藍自交不親和系存在S位點雜合現象在早期的研究中也曾報道（田磊 等，2011）。然而，通過SRK基因序列分析，未能在這7份雜合材料中鑒定出屬于ClassⅡ型的SRK2、SRK5以及SRK15單倍型序列（Tian et al.，2013）。另外，本試驗將S位點雜合的G1（鑒定為SRK36單倍型）分別作為父本和母本與同一S單倍型的E3以及P1花期雜交后均表現為典型的自交不親和特性。說明，即使在S位點上出現ClassⅠ型和ClassⅡ型雜合，仍不影響其花期雜交的不親和性。

通過特異引物擴增僅能將甘藍自交不親和系分為ClassⅠ型和ClassⅡ型兩大類，但不能確定其所屬單倍型（田磊 等，2011）。李霞等（2015）對4份不結球白菜的SRK及SLG基因序列進行克隆分析，初步確定了其所屬單倍型，但未進行相應的親和性試驗?；赟RK基因序列分析，Tian等 （2013）對111份結球甘藍單倍型進行了鑒定，并利用柱頭花粉管熒光鑒定法重點驗證了歸屬于相同S單倍型材料之間親和性。本試驗中，23份甘藍自交不親和系分屬于10個不同的單倍型，未檢測到屬于ClassⅡ型的SRK2、SRK5以及SRK15單倍型，但不同單倍型的分布頻率與Tian 等（2013）在111個結球甘藍自交系上的鑒定結果接近；F1材料被鑒定為SRK7單倍型，與高啟國等（2011）針對該材料SRK基因和SCR基因同時鑒定結果一致。說明利用本試驗中的簡并引物擴增SRK基因序列進行單倍型的確定是可靠的。本試驗還對歸屬于相同S單倍型材料以及不同S單倍型材料之間的親和性，同時采用柱頭花粉管熒光鑒定法以及親和指數測定法進行了驗證，獲得了基于SRK基因序列鑒定相應自交不親和系所屬單倍型與田間鑒定相吻合的直接證據。這些結果支持基于SRK基因序列分析確定對應甘藍自交不親和系所屬單倍型是一種簡單可靠的鑒定方法，可用于指導甘藍自交不親和系之間的雜交組合設計。

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