不同時間電針介入對痛記憶模型大鼠的干預效應*

佘麗嬌 孫 晶 沈 醉 何俏穎 方劍喬 邵曉梅

（浙江中醫藥大學第三臨床醫學院，杭州310053）

當個體受到外界刺激引起了組織損傷或潛在損傷都可能產生疼痛，許多病人在疾病過程中承受持續的疼痛，甚至當初始病灶痊愈后疼痛仍然存在，這一現象被稱為“痛記憶”[1,2]。以痛覺過敏和痛覺超敏為特征的疼痛狀態在大腦中逐漸形成相關記憶與負面情緒，這一過程由疼痛的獲得、鞏固以及恢復組成[3]。疼痛的最初記憶可因情緒成分的夾雜而加重，進而形成更多更復雜的記憶[3]。這一特別現象的發現引起了眾多研究者的興趣。部分研究提出痛覺神經元獲得并將疼痛信號傳遞至大腦相關核團，例如前扣帶皮層 (anterior cingulate cortex，ACC)、前額葉皮層、海馬體、杏仁核和島葉皮層，并通過短期記憶情緒環境下的反復和持續刺激繼而形成長期記憶[4,5]。另有研究表明，痛記憶可能是由于首次炎癥疼痛恢復后，大腦中樞神經系統突觸可塑性的改變引起的[4]。針對痛記憶現象的改善目前還沒有明確的治療手段。臨床上用于治療和改善長期疼痛和慢性疼痛常用的非甾體抗炎藥 (non-steroid anti-in flammatory drugs, NSAIDs)，例如水楊酸類的阿司匹林、吲哚類的吲哚美辛以及丙酸類的布洛芬及芬必得等，雖然具有一定的抗炎鎮痛療效[5]，但未有研究明確其對痛記憶是否有干預作用，且由于非甾體抗炎藥物的胃腸道不良反應[6]，很大程度上限制了這類藥物在疼痛類疾病治療中的長期應用。因此，尋求改善痛記憶現象的有效方法顯得尤為必要。

電針廣泛應用于中醫針灸臨床鎮痛，且療效確切[7~9]。研究者從外周、中樞等多個水平應用現代科學技術與方法闡述了針刺鎮痛的部分機制，并取得了較大的進展[10~12]。但鮮有關于探討電針對痛記憶干預效應的研究，本研究以角叉菜膠足跖二次交叉注射誘發痛記憶模型，觀察不同時間電針和吲哚美辛干預痛記憶的效應差異，篩選治療痛記憶的最佳介入時間和方案，為臨床治療該類疾病提供理論依據。

方 法

1.實驗動物及分組

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重180 ±200 g，購自中國科學院上海實驗動物中心[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，實驗中操作均遵照中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導意見》。實驗前進行適應性喂養4～5天，飼養期間自由攝食及飲水，分籠飼養，12 h晝夜循環光照，室內溫度控制在（22±2）℃。實驗動物分為六組，每組10只，分別為對照組（Control組）、角叉菜膠炎性痛模型組（Model組）、角叉菜膠首次造模加電針組（EA1組）、角叉菜膠二次造模加電針組（EA2組）、角叉菜膠首次造模加吲哚美辛灌胃組（Indo1組）以及角叉菜膠二次造模加吲哚美辛灌胃組（Indo2組）。

2.實驗方法

（1）痛記憶模型制備

實驗中Model組、EA1組及EA2組大鼠均采用Igor Kissin[13]等人提出的角叉菜膠足跖二次交叉注射誘導的痛記憶模型。首次造模，在大鼠左后足跖皮下注射2%角叉菜膠0.1 ml（美國SIGMA公司批號：1408463V）；14天后，各組大鼠痛閾恢復至基礎痛閾水平，在大鼠右側足跖皮下二次注射同劑量的角叉菜膠。觀察二次注射后大鼠左側足跖的痛閾變化，痛閾降低則表明痛記憶造模成功。相同時間點，Control組大鼠則注射相同劑量的0.9%生理鹽水（杭州民生藥業集團有限公司批號：11210283）。

（2）電針治療及其他處理

角叉菜膠首次注射后，EA1組選取大鼠雙側后肢“足三里”穴，采用韓式穴位神經刺激儀(HANS-200E)連接針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇州醫療用品廠）進行電針干預。電針分別連接左右兩側的“足三里”穴和參考電極（足三里后下1 cm）。刺激參數為疏密波2/100 Hz，強度1～2 mA（每10 min增加0.5 mA），時間30 min。干預時間分別為一次注射后4 h、1～5 d行為學檢測前進行干預，連續6次。EA2組大鼠于角叉菜膠二次注射后進行電針干預，選穴和刺激參數與EA1組相同，干預時間為二次注射后4 h、1～3 d行為學檢測前，連續4次。Model組大鼠于相同時間點作與電針干預組大鼠相同的固定處理。Indo1組大鼠與EA1組大鼠于相同時間點，以吲哚美辛（山西云鵬制藥有限公司批號：H14020771）按3 mg/kg劑量灌胃，連續6次。Indo2組大鼠采用相同方法與EA2組大鼠同時間點操作，連續4次，觀察其痛閾的變化。

（3）機械痛閾檢測

采用據經典von Frey絲法[14]改良的動態足底觸覺儀（意大利UGO BASIL公司型號：37450）在一次和二次注射前檢測大鼠雙側后足跖縮足閾(paw withdrawal thresholds, PWTs)作為基礎痛閾值。然后分別檢測一次注射后4 h、1 d、3 d、5 d及二次注射后4 h、1 d、2 d、3 d的機械痛閾值。檢測時，將大鼠單獨放入底面為鐵絲網的有機玻璃盒中，室內溫度保持23～25℃，濕度45%～55%，噪音40 dB以下，休息約20 min左右，待大鼠安靜后開始檢測。不銹鋼探針（直徑0.5 mm）垂直上升至大鼠后足掌底中部（避開足墊）后，以2.5 g/s的速度逐漸增大刺激強度，以大鼠縮足或刺激量達到最大值（50 g）為準，儀器自動記錄縮足時探針觸力。大鼠雙側足跖連續檢測5次，每次間隔約5 min，計算其后4次平均值。檢測時間置于上午9點至下午3點間。各組大鼠于基礎痛閾測量前進行兩天適應性痛閾的檢測，以減少實驗環境對大鼠痛閾的影響。

5．統計方法與分析

采用SPSS軟件統計分析，所有數據以均數±標準誤（x±SEM）表示。PWTs數據多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較，方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett' s T3檢驗；每組間造模前后比較采用配對t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.痛記憶模型

如圖1示，圖1A和圖1B為各組大鼠角叉菜膠首次注射前后左側（注射側）和右側（未注射側）足跖各時段的痛閾變化。從圖1A可見首次造模前，各組大鼠造模側（左側）足跖基礎痛閾無統計學差異。造模后4 h、3 d及5 d測得大鼠痛閾，與Control組相比，Model組大鼠痛閾明顯降低(P< 0.05)。從圖1B可見各組大鼠未造模側（右側）各時段足跖痛閾均無統計學差異。圖1C和1D為各組大鼠角叉菜膠二次造模前后大鼠雙側足跖的痛閾變化。14 d后各組大鼠雙側足跖基礎痛閾已恢復正常，此時開始對之前未造模側（右側）足跖進行角叉菜膠二次造模。如圖1C所示，與Control組相比，Model組大鼠未造模側(左側)足跖痛閾在二次造模后1～3 d明顯下降(P< 0.05)。如圖1D所示，與Control組相比，Model組大鼠造模側（右側）足跖痛閾在4 h、1～3 d明顯下降(P< 0.05)。二次未注射角叉菜膠足跖痛閾下降的現象，被認為是痛記憶發生的證據[15]，因此本研究主要觀察了各組大鼠二次未造模側足跖痛閾的變化情況。

2.電針早期干預與吲哚美辛對痛記憶模型大鼠PWTs的干預效應比較

電針和吲哚美辛于首次造模后干預如圖2所示，圖中可見Model組、EA1組及Indo1組大鼠兩次造模前后雙側足跖的痛閾變化。如圖2A所示，與模型組相比，EA1組及Indo1組大鼠在首次造模后3～5 d造模側（左側）足跖痛閾明顯上升(P< 0.05)，未造模側無明顯差異。二次造模前各組大鼠痛閾恢復至正常值，如圖2C所示，與Model組相比，EA1組大鼠未造模側（左側）足跖痛閾在1～3 d明顯增高(P< 0.05)；Indo1組大鼠未造模側足跖痛閾僅于1 d有明顯增高(P< 0.05)。與Indo1組相比，EA1組大鼠未造模側足跖在2 ～3 d痛閾明顯增高(P< 0.05)。

圖1 各組大鼠首次及二次造模前后雙側足跖PWTs的變化(x±SEM)與Control組相比，*P < 0.05Fig.1 The changes of bilateral PWTs before and after the first or secondary injection of all groups (x±SEM)*P < 0.05，compared Control group.

3.電針后期干預與吲哚美辛對痛記憶模型大鼠PWTs的干預效應比較

電針和吲哚美辛于二次造模后干預如圖3所示，圖中可見Model組、EA1組及Indo1組大鼠二次造模前后未造模側（左側）足跖的痛閾變化。從圖3A及圖3B中可看出，各組大鼠在首次造模前后雙側足跖痛閾均無統計學差異（P> 0.05）。14 d后大鼠足跖痛閾恢復至基礎水平，進行二次造模。從圖3C中可看出，與Model組及Indo2組相比，EA2組大鼠未注射側（左側）足跖痛閾在2～3 d均有明顯增高（P< 0.05）；圖3D中，與Model組相比，EA2組和Indo2組大鼠注射側（右側）足跖痛閾在1～3 d均明顯增高（P< 0.05）。

3.不同時間電針介入對痛記憶模型大鼠機械痛閾的干預效應比較

圖4為電針在首次及二次造模后介入對痛記憶模型大鼠未造模側（左側）足跖痛閾的影響。如圖所示，二次造模前各組大鼠基礎痛閾均無統計學差異。造模后與EA2組相比，EA1組大鼠未造模側（左側）足跖痛閾在2～3 d有明顯增高（P< 0.05）。

討 論

Igor Kissin等人在2006年建立的角叉菜膠足跖二次交叉注射痛記憶模型，由于大鼠造模后的行為學表現與人類炎性疼痛表現相似，被廣泛應用于痛記憶的研究中。痛記憶的形成機制可能與大腦中樞的疼痛信息傳輸與儲存相關[16]。當機體曾經經歷的痛苦或不愉快情緒及其他相關的疼痛信息傳輸至大腦中樞并儲存于記憶中，當類似情景再次發生便會再次喚醒痛記憶并引發逃避厭惡的現象[17,18]。近期有研究表明[19,20]，小鼠腦中存在多種類型的記憶，并且這些記憶可能發生重疊，其中不愉快的部分則會影響行為表現。因此，如何有效擦除痛記憶痕跡以及其相關機制研究顯得尤為必要[21,22]。本次實驗成功復制了“痛記憶”模型，14 d后Model組二次造模，未注射側足跖痛閾明顯下降，提示造模成功，痛記憶被喚醒。

圖2 不同療法早期干預對模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與Model組相比，#P < 0.05; 與Indo1組相比，*P < 0.05Fig.2 The effects of early intervention on pain memory of the model rats (x±SEM)#P < 0.05, compared with Model group; *P < 0.05, compared with Indo1 group.

電針應用廣泛且鎮痛效果明顯有效，其在疾病發生發展的不同時段介入也會產生不同的效應。電針參與下行抑制通路，將大腦中的化學物質傳輸至脊髓細胞中，阻礙疼痛受體產生的疼痛信號從而達到鎮痛效果[23]。之前有研究表明，電針的早期干預可以有效緩解大鼠痛記憶現象的喚醒，其機制可能與脊髓背角 (spinal cord dorsal horn, SCDH) 星形膠質細胞相關[24]。電針可能影響神經營養因子的釋放，例如腦源性營養因子(BDNF)、神經膠質細胞型營養因子(GDNF)等，進而產生鎮痛作用[25]。此外有研究證明，重復電針可明顯改善慢性痛大鼠的痛感覺及痛情緒，其機制可能與大鼠杏仁核GluA1蛋白相關[26]。而早期干預與痛記憶形成后再干預之間的鎮痛效應差異鮮有研究。本實驗在痛記憶模型大鼠一次造模和二次造模各時段介入電針治療，首次造模時介入的EA1組大鼠注射側痛閾明顯上升，且在二次造模痛記憶喚醒后，大鼠未注射側足跖仍然明顯高于Control組。此外，與EA2組相比，EA1組在首次造模與痛記憶喚醒后的痛閾也明顯增高。提示電針的介入能有效阻斷痛記憶現象的喚醒，且早期干預比痛記憶形成之后再介入治療更具有效性。NSAIDs的消炎、鎮痛以及解熱作用明確且廣泛應用于多種急慢性疼痛甚至癌性痛中[27]，但副作用不容忽視[28,29]，這使得對針灸的研究顯得更為必要，便于為臨床提供更優質的治療方式。實驗中，我們采用吲哚美辛灌胃的方式與電針組進行比較，結果提示首次造模時介入的Indo1組大鼠注射側足跖痛閾較Model組明顯升高，而痛記憶形成后，其痛閾并無明顯變化。這表明NSAIDs能有效緩解疼痛現象，但對痛記憶的喚醒并沒有明顯阻斷效應。

圖3 不同療法后期干預對模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與Model組相比，#P < 0.05; 與Indo1組相比，*P < 0.05Fig.3 The effects of later intervention on pain memory of the model rats (x±SEM)#P < 0.05，compared with Model group; *P < 0.05，compared with Indo1 group.

圖4 不同時間電針干預對模型大鼠痛記憶的影響(x±SEM)與EA2組相比，*P < 0.05Fig.4 The effect of EA at different intervention time on pain memory of the Model rats (x±SEM)*P < 0.05, compared with EA2 group.

本研究結果揭示了電針對痛記憶有抑制作用，且早期干預優于晚期干預，這為臨床應用針灸治療疼痛類疾病提供良好的理論研究基礎。常用NSAIDs對痛記憶無明顯干預效應，提示電針和NSAIDs雖可能均有相似鎮痛機制，但對痛記憶的干預作用不盡相同。

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