氯化血紅素與十二烷基-β-D-麥芽糖苷復合膠團的催化氧化性能

王小強, 王 超, 潘美紅, 陳 韓

(中國石油大學生物工程與技術中心蛋白質分子工程實驗室,山東青島 266580)

在生命體系中,氧化反應通過金屬蛋白酶(如過氧化物酶)的催化作用來實現[1],該反應在常壓、室溫和水相中進行,并且大多數情況下催化活性位點為環境友好的鐵元素。大多數催化氧化反應的金屬酶活性部位是一個較寬的疏水“口袋”,用于容納氯化血紅素輔酶和底物。氯化血紅素的化學結構為鐵(Ⅲ)卟啉,本身不溶于酸性和中性水溶液,很容易聚集,同時在大多數的有機溶液中溶解性也很差。氯化血紅素可與各種氧供體化合物(如亞碘酰苯、過氧酸、過氧化氫、烷基氫過氧化物、次氯酸鈉、過硫酸氫鉀等)發生反應生成Fe(Ⅴ)-O復合體以催化底物氧化[2]。由于過氧化氫是一種溶于水的環境友好型氧化劑,反應副產物為水,所以體外模擬研究大多數都使用過氧化氫作為氧原子供體[3-5]。烷基糖苷由脂肪醇和葡萄糖合成,是一種性能較全面的新型非離子生物表面活性劑,具有起泡性好、溶解性強、耐強堿和電解質、生物相容性好等特點,是公認的“綠色”功能性表面活性劑[6-8]。DDM膠束能夠很好地溶解和穩定氯化血紅素,形成的復合體系具有類似過氧化酶的催化能力?；诜律瘜W與綠色化學的理念,筆者采用烷基糖苷類非離子表面活性劑十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM),利用它在水溶液中形成穩定、中心疏水的膠束結構,構建其與氯化血紅素形成的復合膠團,考察該體系的催化氧化性能，并測定其相關反應動力學常數,探討反應機制。

1 實 驗

1.1 試劑和儀器

試劑:氯化血紅素(hemin),Frontier Scientific生產;十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM),SIGMA生產;過氧化氫(H2O2),國藥集團化學試劑有限公司生產;酸性橙(Orange Ⅱ),北京百靈威科技有限公司生產。

儀器:動態光散射儀;紫外可見分光光度計,附恒溫水浴鍋;吸光度均用10mm 比色皿;HI8424便攜式防水pH酸度計(哈納沃德儀器(北京)有限公司);KQ-100KDE型高功率數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氯化血紅素母液的配置

含10% DDM的1 mmol/L氯化血紅素母液:用1 mL濃度為20 mmol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液溶解0.652 mg氯化血紅素和0.1 gDDM,超聲10 min混勻,使氯化血紅素更好的分散,并放于4 ℃冰箱中貯存,如圖1所示,用于后續實驗。實驗時將母液用不同pH值的10 mmol/LPBS緩沖液進行稀釋,所得溶液pH值不會因氯化血紅素溶液中氫氧化鈉的存在而發生變化。不含DDM的氯化血紅素母液:直接用20 mmol/L氫氧化鈉溶液溶解0.652 mg氯化血紅素,實驗時再用PBS緩沖液進行稀釋。

圖1 氯化血紅素-DDM復合體的結構和催化過程Fig.1 Structure of hemin-DDM complex and catalytic process

1.2.2 氯化血紅素-DDM復合體系表征

分別利用動態光散射儀和紫外可見分光光度計對氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合體系進行分析與比較。利用動態光散射儀測定氯化血紅素與氯化血紅素-DDM復合膠團的水力直徑分布,參數設定時將測定類型設為粒徑,分散劑選定為水,溫度設置為25 ℃,平衡時間為120 s,池子型號選用ZEN2112。首先測得含DDM的PBS緩沖液的水力直徑分布并作為空白對照,然后用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合體系至終濃度為150 μmol/L,再使用動態光散射儀表征和對比兩種溶液的水力直徑分布情況。

為進一步驗證氯化血紅素的分散情況,實驗用pH值為7.0的PBS緩沖液將氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合體系稀釋到濃度為25 μmol/L,然后通過測定其紫外可見吸收光譜進行分散情況分析。同時,作為對照實驗,用氫氧化鈉溶液將氯化血紅素母液稀釋到25 μmol/L,并記錄氯化血紅素其其紫外可見吸收光譜。

1.2.3 催化動力學

在催化劑的作用下,酸性橙會被過氧化氫快速氧化降解(圖2)。氯化血紅素在不同的pH值和溫度下,將0.25 mmol/L的酸性橙溶液,6.85 mmol/L的H2O2溶液和不同濃度的氯化血紅素溶液以相同體積混合。酸性橙在紫外可見分光光度計上的特征吸收峰在509 nm處。催化反應動力學實驗過程中,記錄酸性橙509 nm處吸光度隨時間的變化。分別配置pH值為5、6、7、8的PBS緩沖液,并用不同pH值的PBS緩沖液分別稀釋氯化血紅素母液,使其達到所需的濃度及pH值。溫度的控制則通過與分光光度計配套的循環恒溫水浴來實現。

圖2 酸性橙被過氧化氫氧化降解過程Fig.2 Degradation of Orange Ⅱ by H2O2 with hemin-DDM as a catalyst

研究氯化血紅素對底物的催化的動力學參數時,通過固定一個底物濃度和同時改變另一個底物濃度,測定酸性橙的降解過程,并根據Linerweaver-Burk模型擬合求得相應參數。固定酸性橙濃度為0.25 mmol/L,設置過氧化氫濃度梯度(1、2、4、8、16 mmol/L),催化劑氯化血紅素濃度為150 μmol/L,測得反應動力學;同理,固定過氧化氫濃度為6.85 mmol/L,設置酸性橙濃度梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mmol/L),催化劑氯化血紅素濃度為150 μmol/L,測得反應動力學。

首先通過測定一系列不同溫度下酸性橙在509 nm處的吸光系數并取平均,獲得可靠的的摩爾吸光系數(ε509 nm)。反應的初速度可通過以下方程求得:

Δc=Δfabs/(εb),v=Δc/Δt.

式中,fabs為吸收峰的強度;ε為摩爾吸光系數;b為光程(光透過池子的厚度);c為底物濃度;t為時間;v為初速率。

米氏常數(Km)和最大反應速率(vmax)通過Linerweaver-Burk模型計算得到。Linerweaver-Burk模型是米氏方程通過取雙倒數所得。實驗得到的數據通過以下方程進行分析:

式中,S為底物濃度。

測出不同底物濃度下的初速率,然后Km和vmax可以通過直線擬合v和S的倒數來獲得。

根據前期探索實驗,催化反應均在60 min內基本完成,通過以下方程求得不同條件下反應60 min后的轉化率,并進行比較分析:

y=(A0-A60)/A0.

式中,A0為0時刻酸性橙的吸光度;A60為反應60 min后的吸光度。

2 結果分析

2.1 氯化血紅素-DDM復合體系表征

氯化血紅素非常難溶于酸性和中性介質中,同時在大多數有機溶劑中的溶解性也很差。由于氯化血紅素有兩個羧基,在堿性溶液中通常會有相對好的溶解性。分別配置氯化血紅素的NaOH水溶液(氯化血紅素濃度為1 mmol/L)和含10%DDM的氯化血紅素的NaOH溶液(1 mmol/L),用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋至氯化血紅素終濃度為150 μmol/L,使用動態光散射儀表征和對比了2種情況下,氯化血紅素的水力直徑分布情況,以反映DDM膠束對氯化血紅素的分散和穩定能力。作為對照實驗,同時表征了10% DDM溶液的水力直徑分布。結果見圖3。

圖3 不同體系水力直徑分布Fig.3 Comparsion of different system hydrodynamic diameter distribution

圖3(a)為10%DDM溶液的水力直徑分布情況,圖3(b)為在表面活性劑DDM存在情況下,將氯化血紅素-DDM用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋后的水力直徑分布結果;圖3(c)為在沒有表面活性劑存在的情況下,將氯化血紅素母液用PBS緩沖液(pH值為7)稀釋后的水力直徑分布結果。動態光散射儀結果顯示,DDM膠束的平均水力直徑約為5.1 nm,氯化血紅素-DDM復合體的平均水力直徑約為5.5 nm,而氯化血紅素的平均水力直徑約為7.3 nm。這表明DDM膠束對氯化血紅素有很好的分散和穩定效果,并形成復合膠團,而且插入氯化血紅素后對DDM膠束的尺寸影響不大。

為進一步驗證氯化血紅素在DDM膠束中有很好的分散性,采用紫外可見分光光譜進行比較分析。圖4為25 μmol/L氯化血紅素的氫氧化鈉溶液、氯化血紅素和氯化血紅素-DDM在PBS緩沖液(pH 值為7)中的紫外可見光譜?？梢钥闯?25 μmol/L氯化血紅素在氫氧化鈉溶液中有一個390 nm的特征峰和一個360 nm的肩峰;而25 μmol/L氯化血紅素溶于PBS緩沖液中有一個370 nm的特征峰,表明同時有氯化血紅素二聚體(通過μ-氧橋鍵連接)和單體氯化血紅素氫氧化物存在。μ-氧化二聚體對氯化血紅素在水溶液中的影響非常大,并進一步影響氯化血紅素的催化活性[9-10]。氯化血紅素-DDM溶液在404 nm處有吸收峰,為氯化血紅素單體的特征峰,同時伴有一個365 nm的肩峰。這表明DDM形成的膠束將氯化血紅素包裹在里面,同時由于疏水相互作用力,氯化血紅素在DDM中多以單體的形式存在。由此看出:無表面活性劑存在下氯化血紅素多以二聚體的形式存在于水溶液中;在氯化血紅素-DDM復合膠團中氯化血紅素多以單體形式存在并伴有少量的氯化血紅素二聚體[11]。

圖4 體系的紫外可見吸收光譜Fig.4 UV-vis spectra of systems

2.2 氯化血紅素-DDM復合膠團氧化性能表征

氯化血紅素-DDM復合膠團的活性通過酸性橙和過氧化氫作為底物進行評估。酸性橙有最簡單的偶氮染料結構,并被用來作為一種模式染料用來檢測生物和化學處理[12]。在過氧化氫酶作為催化劑的條件下,偶氮結構能被過氧化氫破壞[13]。酸性橙降解引起的吸光度降低通過紫外可見分光光度計在509 nm處被檢測。圖5(a)為紫外可見光譜隨反應的變化。在過氧化氫、酸性橙和氯化血紅素-DDM復合膠團共存時,在509 nm處的吸收光譜降低,該現象表明酸性橙的氧化;而在無氧化劑存在下,以PBS緩沖液代替過氧化氫溶液進行體系混合,發現氯化血紅素的吸收則不會影響酸性橙509 nm處的吸收。

圖5 血紅素的催化活性與溫度、pH值和血紅素濃度的關系Fig.5 Relations of catalytic activity of temperature, pH value and hemin concentration

2.2.1 催化反應初速率

酶的活性依賴于底物和反應條件。因此,氯化血紅素-DDM復合膠團的催化活性可能依賴于pH值,溫度,氯化血紅素濃度和底物濃度。首先通過不同溫度下酸性橙的摩爾吸光系數,求得酸性橙的平均摩爾吸光系數為16.3 L/(mmol·cm)(表1),通過其特征性吸收峰的強度變化可以換算成底物濃度的變化,并進一步求得催化反應動力學參數。催化反應活性通過2個參數確定:初速率(v)和1 h內的轉化率(y)。由圖5(b)～(d)看出:當溫度在50 ℃及以下,氯化血紅素-DDM復合膠團的催化氧化速率要高于氯化血紅素;當pH值小于8,氯化血紅素-DDM復合膠團的催化氧化速率均高于氯化血紅素;催化氧化速率依賴于催化劑的濃度,濃度越高,催化氧化速率越快;在150 μmol/L及其以下的濃度時,氯化血紅素-DDM復合膠團均比氯化血紅素的催化氧化速率快。

表1 不同溫度下酸性橙的摩爾吸光系數Table 1 Molar absorption coefficient of Orange Ⅱ in different temperature

2.2.2 轉化率

圖6表明:氯化血紅素-DDM復合膠團和氯化血紅素的轉化率都隨溫度的增加而增加,氯化血紅素-DDM復合膠團對溫度的敏感性更大一些,而氯化血紅素的敏感性相對較小一些;氯化血紅素-DDM復合膠團和氯化血紅素對pH值都有一定的敏感性,并且氯化血紅素敏感性更大一些;在pH值為8時,氯化血紅素的轉化率超過氯化血紅素-DDM復合膠團的轉化率,這是由于氯化血紅素在堿性條件下更容易溶解,不易形成二聚體,氯化血紅素單體能更好的穩定住,從而導致轉化率的提高;氯化血紅素-DDM復合膠團與氯化血紅素對濃度的敏感性較小,在較低濃度與較高濃度的時候,氯化血紅素-DDM復合膠團與氯化血紅素的轉化率都出現了無規律的增大和降低現象,可能的原因是氯化血紅素在濃度過低或者過高的時候不穩定,易發生其他反應。整體來講,氯化血紅素催化反應的轉化效率很低,推測原因如下:①氯化血紅素在催化氧化過程中出現自氧化現象,從而導致轉化效率的降低;②氯化血紅素-DDM在催化過程中與底物不能很好地結合,并且生成的產物不易擴散出膠束,最終導致轉化率低。由此可知,氯化血紅素-DDM復合膠團的催化活性受溫度的影響比氯化血紅素大,受pH值和濃度的影響與氯化血紅素相差不大,這表現出氯化血紅素-DDM對環境條件的變化能有更好的抵抗性。

圖6 氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合膠團催化酸性橙氧化反應的轉化率Fig.6 Conversions of degradation reaction catalyzed by hemin and hemin-DDM micelle

2.2.3 米氏常數及最大反應速率測定

考察底物對氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合膠團的催化性能的影響。通過改變實驗中酸性橙和過氧化氫的濃度,確定過氧化物類似酶氯化血紅素和氯化血紅素-DDM復合膠團的催化反應動力學參數,結果見圖7。由圖7可求得Km和vmax(表2)。

圖7 氯化血紅素和氯化血紅素-DDM催化反應的Km和vmaxFig.7 Measurement of Km and vmax of reactions catalyzed by hemin and hemin-DDM

催化體系底物Km/(mmol·L-1)vmax/(10-4mmol·L-1·min-1)氯化血紅素OrangeⅡH2O20.22.85.45.3氯化血紅素-DDMOrangeⅡH2O20.14.66.09.2

催化體系與底物之間Km越小,兩者之間的吸附力就越強,進而表明催化劑有更高的催化效率。從表2看出,氯化血紅素以酸性橙為底物的Km值比氯化血紅素-DDM復合膠團的值大一些,而以過氧化氫為底物的Km要小。原因是酸性橙具有苯環結構,這種結構導致了其具有一定的疏水性,使其能很好地進入到DDM膠團中與氯化血紅素進行反應,所以氯化血紅素-DDM復合膠團以酸性橙為底物的Km值較小,酸性橙與氯化血紅素的結合力較強;而過氧化氫是易溶于水的液體,親水性很強,導致其不容易進入到DDM疏水腔體里面,進而影響氯化血紅素與過氧化氫的結合與反應,因此氯化血紅素-DDM復合膠團以過氧化氫為底物時的Km值較大,過氧化氫與氯化血紅素的結合力較弱。而以最大反應速率作為比較來看,氯化血紅素-DDM復合膠團以酸性橙作為底物時的最大反應速率稍大于氯化血紅素的最大反應速率,而以過氧化氫為底物時的最大反應速率就遠大于氯化血紅素的最大反應速率。綜上所述,氯化血紅素-DDM復合膠團跟底物有較好的結合力,并且催化效率高。

3 結 論

(1)在表面活性劑DDM存在的條件下,DDM所形成的兩性膠束能夠很好地包裹住氯化血紅素,使氯化血紅素與DDM膠束能夠形成氯化血紅素-DDM復合膠團,進而對氯化血紅素起到很好的分散性和溶解性的效果,氯化血紅素顆粒分散比較好,單體存在比較均勻分散,能更好更穩定的儲存。

(2)氯化血紅素-DDM復合膠團與氯化血紅素純溶液相比的優勢在于氯化血紅素-DDM復合膠團更加穩定,氯化血紅素處于膠束的疏水腔中不易形成二聚體,更易于儲存。

(3)氯化血紅素-DDM復合膠團在對溫度和濃度的敏感性較大,對pH值的敏感性較小,這有利于氯化血紅素-DDM復合膠團在各種環境中發揮催化氧化反應。

(4)氯化血紅素-DDM復合膠團跟底物有很好的結合力,并且催化效率高。

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