利用廢棄煙梗發酵生產白僵菌的響應面優化

陳辰 朱潤琪 臧曉靜 劉麗 馬軒 葉曉婉 劉珍珍 谷萌萌 席宇 朱大恒

摘 要：為實現廢棄煙梗資源化利用，以廢棄煙梗為主要發酵底料，白僵菌產孢量為響應值，采用響應面法（Response Surface Methodology，RSM）對煙梗發酵生產白僵菌的條件進行了優化。通過Plackett-Burman（PB）試驗篩選出影響廢棄煙梗發酵生產白僵菌最顯著的因素，設計最陡爬坡試驗逼近最佳條件區域，進一步設計Box-Behnken Design（BBD）響應面優化，分析并確定最佳條件。結果表明，當培養時間為9.40 d，蛋白胨含量1.21%，酵母粉含量1.03%時，白僵菌孢子產量預測最優值為1.17×1010個/g，實際孢子產量為1.13×1010個/g，擬合度達到96.58 %，白僵菌產孢量顯著提高。因此，采用該方法優化得到的最佳發酵條件合理而有效，對煙草生物防治以及煙梗廢料的綜合利用具有實際應用價值。

關鍵詞：白僵菌；廢棄煙梗；固態發酵；響應面法優化

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）02-0046-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.007

Optimization of Fermentation Conditions of Beauveria bassiana Using Waste Tobacco Stem as Fermentation Substrate with Response Surface Methodology

CHEN Chen1， ZHU Runqi2， ZANG Xiaojing1， LIU Li1， MA Xuan1， YE Xiaowan1， LIU Zhenzhen1， GU Mengmeng1， XI Yu1， ZHU Daheng1*

（1. College of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， China； 2. College of Pharmacy， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430074， China）

Abstract： In order to realize the resource utilization of waste tobacco stems and improve the application status on waste tobacco stem， using waste tobacco stem as fermentation substrate， and the production of Beauveria bassiana as response value， the fermentation process of Beauveria bassiana was optimized using the response surface methodology （RSM）. Through Plackett-Burman （PB） design， the most significant factors affecting the production of Beauveria bassiana using waste tobacco stem as fermentation substrate were identified. Based on the results of the Plackett-Burman （PB） experiment， the steepest ascent experiment was used to approach the optimal region， and the mathematical model of optimization of Box-Behnken Design （BBD） response surface was established to determine the optimal conditions. The results showed that when the incubation time was 9.40 days， concentration of peptone and yeast powder was 1.21% and 1.03% respectively， the prediction spore yield of Beauveria bassiana was 1.17×1010/g， the actual spore yield was 1.13×1010/g， and the fitting degree was 96.58%. Therefore， the optimal fermentation conditions from RSM are reasonable， and have practical application value in microbial prevention and control and the comprehensive utilization of waste tobacco stems.

Keywords： Beauveria bassiana； waste tobacco stem； solid-state fermentation； response surface methodology

白僵菌（Beauveria bassiana）作為一種昆蟲病原真菌，在病害蟲的防治與調控中具有重要的作用，因其寄生范圍廣，可侵染種類多、數量大（包括15個目、149個科的700多種昆蟲及蜱螨目的6科10

基金項目：河南省教育廳科學技術研究重點項目“煙草廢棄物發酵聯產單細胞蛋白和草炭技術研究”（13B180358）；鄭州大學大學生創新創業訓練計劃資助項目“有機廢水資源化利用生物工藝研究”（2015xjxm198）；國家自然科學基金項目（31401918）

作者簡介：陳 辰（1994-），男，碩士研究生，研究方向為微生物學與煙草生物工程。E-mail：chenchenem@aliyun.com

*通信作者，E-mail：zhudaheng2000@aliyun.com

收稿日期：2017-11-15 修回日期：2018-01-29

余種螨和蜱），易大規模生產等特點[1]，并且具有專一性強、對人畜無害、防治效果好、生物降解無殘毒等優點[2-3]，從而被認為是目前世界上研究和應用最廣泛的生物殺蟲劑之一[4-7]，在病蟲害防治中發揮著越來越重要的作用[8-10]。但目前固態發酵白僵菌大多是糧食生物質底料作為發酵基質[11]，例如麥麩、棉籽、米糠、碎米和稻殼等，成本較高，成為限制白僵菌推廣的主要因素之一，所以尋找合適的廉價廢棄原料物發酵生產白僵菌，不僅能夠降低生產成本，而且能夠降低污染，實現資源的回收再利用，已成為當前的熱點領域。

煙梗是煙草卷煙工業的副產物[12]，占煙葉總重的20%～30%[13]，主要堆積于打葉復烤廠的倉庫中，嚴重浪費倉儲資源，目前對廢棄煙梗的處理主要采用造紙法生產煙草薄片，但生產過程耗能耗熱量大、產生的污水量高[14]，對環境造成污染。煙梗中含有豐富的糖類、氮類、磷、鈣、鉀等營養物質[15-18]，可作為發酵培養基質[19-20]。李超等[21]以廢棄煙梗提取液為底物進行液態發酵，采用正交組合試驗設計，對蘇云金芽孢桿菌的培養基成分和發酵條件進行優化，結果表明，優化后蘇云金芽孢桿菌產量明顯增加。郭大城等[22]采用Plackett-Burman（PB）試驗對影響深紅酵母（Rhodotorula rubra）JLC發酵煙梗廢料產類胡蘿卜素的相關因素進行了分析和篩選，結果表明，在PB試驗條件下，JLC發酵產類胡蘿卜素產量明顯提高，可達21.54 ?g/g。

目前關于利用廢棄煙梗發酵生產白僵菌的研究未見報道。本試驗以煙梗為主要發酵底料，在前期初步探究發酵因素（水分含量、發酵溫度、pH值等）的基礎上，進一步優化完善培養基和發酵工藝條件，以使廢棄煙梗利用率和白僵菌產孢量實現最大化。通過PB試驗從初選的相關因素中篩選出影響白僵菌產孢量的主要效應因子，進一步設計最陡爬坡試驗逼近最優條件區域，然后設計Box-Behnken Design-Response Surface Methodology（BBD-RSM）優化，分析并確定最佳發酵條件，使白僵菌產孢量達到最大值，旨在為廢棄煙梗資源化應用和生物防治領域相關微生物資源的開發提

供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：廢棄煙梗，由天昌國際煙草有限公司提供（直徑為0.30～0.50 cm，長度為4.0～5.0 cm）。

1.2 煙梗預處理

將廢棄煙梗于60 ℃下烘干至恒重，粉碎過16目標準篩除塵，與蒸餾水按1∶3.5質量比混合，常溫下浸泡16 h，1×105 Pa滅菌20 min作為廢棄煙梗發酵預培養基。

1.3 菌種及培養基

菌種：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）（菌種編號：ACCC30713），商業菌種，菌種保藏及活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）斜面培養基，瓊脂含量為1.8%，4 ℃保存備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，培養基配制方法參考文獻[23]；液體種子培養基，同PDA培養基，不加瓊脂即可；篩選固態發酵培養基，經預處理的原梗10 g；蛋白胨，鄭州創生生物工程有限公司；酵母粉，英國OXOID公司；葡萄糖、NH4NO3、NaH2PO4、FeSO4、MnSO4均為分析純，天津市科密歐化學試劑開發中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液的制備 從PDA斜面培養基上挑取白僵菌菌種，接入裝有50 mL液體種子培養基的錐形瓶中，28 ℃、180 r/min條件下培養48 h。

1.4.2 Plackett-Burman試驗設計 選用N=12的Plackett-Burman（PB）設計對初選的影響廢棄煙梗發酵產白僵菌的9種相關因素：接種量、培養時間、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4進行考察分析，以白僵菌孢子產量為響應值，每種因素取高（+）低（?）兩個水平，高水平倍數不超過低水平2倍，因素之間間隔分布，每組3個重復，孢子產量取平均值，9種因素的編碼、單位及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設計因素與水平

Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman Design

編碼Code 因素Factor 水平Level

-1 +1

X1 接種量/% 5 10

X2 培養時間/d 5 10

X3 葡萄糖/% 0 0.2

X4 蛋白胨/% 0 0.5

X5 酵母粉/% 0 0.5

X6 NH4NO3/% 0 0.5

X7 NaH2PO4/% 0 0.2

X8 MnSO4/% 0 0.2

X9 FeSO4/% 0 0.2

1.4.3 最陡爬坡試驗設計 根據PB試驗選取對白僵菌孢子產量影響最顯著的3個因素：培養時間（X2）、蛋白胨含量（X4）、酵母粉含量（X5）進行最陡爬坡試驗。由于這3個因素對白僵菌孢子產量都有明顯的正效應，因此將它們的含量逐漸增加以此來尋找最佳響應區域，根據PB試驗結果設定變化方向與步長，每組3個重復，孢子產量取平均值，具體設計如表2所示。

1.4.4 BBD-RSM Design 采用Box-Behnken Design響應面法，在PB試驗的基礎上，根據最陡爬坡試驗結果，設計Box-Behnken Design，每組處理3個重復，孢子產量取平均值，各因素及水平取值見表3。

1.4.5 白僵菌孢子數測定 發酵結束后向培養瓶中加入含有0.5 %吐溫80的蒸餾水70 mL，28 ℃、180 r/min條件下振蕩20 min，分兩次洗脫白僵菌孢子，將兩次洗脫液合并制成白僵菌孢子液，采用25×16型血球計數板直接計數，計算公式為：

白僵菌孢子數=50000×A×B×V/m

其中：A—5個中格內白僵菌孢子的總數；

B—稀釋倍數；

V—白僵菌孢子液的體積；

m—物料的質量

1.5 數據處理

試驗數據采用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0.6進行統計和分析。

2 結 果

2.1 Plackett-Burman試驗

2.1.1 Plackett-Burman設計及響應值 試驗方案及響應值見表4。由表4可知，響應值白僵菌孢子產量在試驗過程中變化幅度較大，表明所選因素對白僵菌產孢量有顯著影響。

表2 最陡爬坡試驗設計

Table 2 Design of Steepest Ascent Experiment

試驗組

Experimental group 培養時間

Incubation

time/d 蛋白胨

Peptone/% 酵母粉

Yeast powder/%

1 6 0.3 0.3

2 7 0.5 0.5

3 8 0.7 0.7

4 9 0.9 0.9

5 10 1.1 1.1

6 11 1.3 1.3

7 12 1.5 1.5

表3 Box-Behnken試驗設計因素與水平

Table 3 Factors and levels in Box-Behnken Design

因素Factor 水平Level

-1 0 1

培養時間/d

Incubation time/d 7 9 11

蛋白胨/%

Peptone/% 0.5 0.9 1.3

酵母粉/%

Yeast powder/% 0.5 0.9 1.3

表4 PB試驗設計及結果

Table 4 Design and results of Plackett-Burmant Design

試驗組 Experimental group X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 孢子產量 Spore yield/（109·g-1）

1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 8.94

2 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 8.14

3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 8.02

4 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 3.78

5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 3.42

6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 6.76

7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 3.30

8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 1.67

9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 7.28

10 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 4.99

11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 7.59

12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 4.21

2.1.2 Plackett-Burman設計各因素效應分析 各因素的影響度和模型貢獻率如表5所示。影響度[24]是指模型中的某個因素從低水平（?1）向高水平（+1）變化時對模型響應值所產生的影響，其中負值表示該因素對響應值具有負效應，影響度值越大說明該影響因子對響應值的影響越顯著。模型貢獻率[25]是指模型中某個因素的平方和占模型中所有因素平方和的總和的比例，其值大小表明該因素對響應值影響程度的大小。

本試驗P值為0.0013，表明模型高度顯著。其中接種量、培養時間、蛋白胨、酵母粉、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4為有意義的模型參數（P值均小于0.05）。但是接種量、NH4NO3、NaH2PO4、MnSO4、FeSO4的模型貢獻率較低，對孢子產量影響較小。根據模型貢獻率、影響度和P值綜合評價，培養時間、蛋白胨含量、酵母粉含量為影響白僵菌產孢量的主要效應因子，因此選取培養時間、蛋白胨、酵母粉3個因素，采用響應面分析法作進一步的探究。

表5 PB試驗設計效應分析

Table 5 Statistical analysis of Plackett-Burman design

因素

Factor 影響度/% 模型貢獻率/% P值

Effect/% Contribution/% P Value

模型 Model ― ― 0.0013

X1接種量 Inoculum concentration 6.51 2.03 0.007

X2培養時間 Incubation time 42.23 85.54 0.0002

X3葡萄糖 Glucose 0.59 0.017 ―

X4蛋白胨 Peptone 8.8 3.72 0.0038

X5酵母粉 Yeast powder 9.22 4.07 0.0035

X6 NH4NO3 6.39 1.96 0.0073

X7 NaH2PO4 2.7 0.35 0.0387

X8 MnSO4 -3.94 0.74 0.0188

X9 FeSO4 4.49 0.97 0.0145

2.2 最陡爬坡試驗結果

根據PB試驗結果，對白僵菌孢子產量影響最顯著的3個因素培養時間、蛋白胨含量、酵母粉含量設計最陡爬坡試驗，結果如圖1所示。

由圖1可知，培養時間對白僵菌的孢子產量影響顯著，隨著培養時間的延長，孢子產量增加，且從試驗組3到試驗組4的孢子產量增幅最大、差異最為顯著，試驗組4到7的白僵菌孢子產量雖有所

注：圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平上的顯著性差異。

Note： Values of spore yield marked by different lowercase letters in the graph indicate significant difference at the level of P<0.05.

圖1 最陡爬坡試驗結果

Fig. 1 Results of Steepest Ascent Design

增加，但差異均不明顯，而且考慮到延長培養時間會增加生產成本，因此以試驗組4為中心點，每個因素取3水平，以（?l，0，1）編碼，設計Box-Behnken Design，以篩選出培養時間、蛋白胨和酵母粉含量的最優配比。

2.3 響應面優化

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及響應值 根據PB和最陡爬坡試驗結果，對選取的3種主要效應因素培養時間（A）、蛋白胨（B）和酵母粉（C）含量進行Box-Behnken試驗，響應值為孢子產量，設置17個試驗點，其中12個試驗點為析因點，其余5個試驗點為零點，零點的主要作用是估計試驗誤差，具體設計和響應值見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計及其試驗結果

Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken Design

試驗組

Experimental group A B C 孢子產量

Spore yield/（109·g-1）

實際值

Experimental

value 預測值

Predicted

value

1 ?1 ?1 0 7.69 7.92

2 1 ?1 0 8.52 8.66

3 ?1 1 0 9.22 9.09

4 1 1 0 10.76 10.53

5 0 0 0 10.84 11.34

6 1 0 ?1 9.49 9.45

7 ?1 0 1 8.71 8.75

8 0 0 0 11.09 11.34

9 0 ?1 ?1 9.58 9.49

10 0 1 ?1 10.56 10.83

11 0 0 0 11.09 11.34

12 0 1 1 11.32 11.41

13 ?1 0 ?1 8.58 8.44

14 0 0 0 10.89 11.34

15 0 ?1 1 9.98 9.71

16 1 0 1 9.80 9.94

17 0 0 0 10.89 11.34

2.3.2 二次回歸模型擬合及方差分析 通過多元回歸法對試驗數據進行分析，得到回歸方程：

Y=11.34+0.55A+0.76B+0.20C+0.18AB+0.045AC+0.090BC-1.75A2-0.54B2-0.44C2

其中Y代表白僵菌孢子產量（109個/g），A、B和C分別代表培養時間/d、蛋白胨含量/%和酵母粉

含量/%。

方差分析結果如表7所示，模型P值為0.0003，表明該模型高度顯著。決定系數R2為0.9637，表明模型的相關性較好，變異系數為3.54 %，值較小，表明該模型能夠有效地反映真實值的情況。

表7 響應面方差分析

Table 7 ANOVA for Box-Behnken Design

方差來源

Source of variance 平方和

Sum of square 自由度

Degree of freedom 均方

Mean of square F P 顯著性

Significance

模型

Model 23.51 9 2.61 20.67 0.0003 ***

A 2.39 1 2.39 18.89 0.0034

B 4.64 1 4.64 36.68 0.0005

C 0.32 1 0.32 2.53 0.1556

AB

AC 0.13

0.007 1

1 0.13

0.007 1.00

0.064 0.3513

0.8074

BC 0.032 1 0.032 0.26 0.6282

A2 12.95 1 12.95 102.46 <0.0001

B2 1.22 1 1.22 9.67 0.0171

C2 0.82 1 0.82 6.49 0.0383

殘差Residuals 0.88 7 0.13

失擬項Lack of fit 0.34 3 0.11 0.85 0.5341 ns

凈誤差Pure error 0.54 4 0.13

總差Total 24.40 16

R2-0.9637 R2adj-0.9171 R2pred-0.9393

Adeq Precision-12.813 C.V. %-3.54

注：***，P<0.001；ns，不顯著。Note： ***，P<0.001. ns means no significance.

2.3.3 響應面分析及最佳發酵條件的確定 根據回歸方程繪制響應面和等高線圖，結果如圖2、3、4所示。由圖可知，培養時間（A）、蛋白胨含量（B）的交互作用以及培養時間（A）、酵母粉含量（C）的交互作用顯著，而蛋白胨含量（B）和酵母粉含量（C）交互作用不明顯。從響應圖和模型分析可知回歸方程存在最大值，最優條件為：培養時間9.40 d，蛋白胨1.21 %，酵母粉1.03 %時，白僵菌產孢量預測最優值為1.17×1010個/g。

由圖2可知，當培養時間（A）處于最優值時，隨著蛋白胨含量（B）的增加，白僵菌孢子產量逐漸升高，但升高幅度不明顯，表明蛋白胨含量對白僵菌孢子產量有一定的影響。當蛋白胨的含量處于一定范圍內，隨著培養時間的延長，白僵菌孢子產量先增加后減少，變化幅度較大，表明培養時間的變化對白僵菌孢子產量具有顯著的影響，培養時間過短或過長都不利于白僵菌孢子產量的提高。培養時間與蛋白胨含量交互作用的等高線圖呈橢圓形，表明交互作用顯著。

圖2 培養時間（A）與蛋白胨含量（B）交互作用對白僵菌產孢量的響應面與等高線圖

Fig. 2 Surface and contour plot showing interactions between incubation time （A） and peptone concentration （B） on spore content of Beauveria bassiana

由圖3可知，當酵母粉含量（C）處于最優值時，隨著培養時間（A）的逐漸延長，白僵菌孢子產量先增加后減少，表明培養時間的變化對白僵菌孢子產量具有顯著的影響，培養時間過短或過長，都不利于固態發酵白僵菌孢子產量的增加。當培養時間處于一定范圍內，隨著酵母粉含量的增加，白僵菌孢子產量沒有明顯的變化，表明酵母粉含量對白僵菌孢子產量的影響不顯著。培養時間和酵母粉含量交互作用的等高線圖接近橢圓形，表明交互作用顯著。

由圖4可知，當蛋白胨含量（B）處于一定范圍內，隨著酵母粉含量（C）的增加，孢子產量幾

乎沒有變化，表明酵母粉含量對白僵菌產孢量影響不顯著；當酵母粉含量處于一定范圍內，隨著蛋白胨含量的增加，白僵菌孢子產量逐漸增加，表明蛋白胨含量對白僵菌孢子產量影響明顯。蛋白胨與酵母粉含量交互作用的等高線圖接近圓形，表明交互作用不顯著。

圖3 培養時間（A）與酵母粉（C）交互作用對白僵菌產孢量的響應面與等高線圖

Fig. 3 Surface and contour plot showing interactions between incubation time （A） and yeast powder concentration （C） on spore content of Beauveria bassiana

圖4 蛋白胨（B）與酵母粉（C）交互作用對白僵菌產孢量的響應面與等高線圖

Fig. 4 Surface and contour plot showing interactions between peptone concentration （B） and yeast powder concentration （C） on spore content of Beauveria bassiana

2.3.4 模型驗證 通過BBD-RSM優化得到利用廢棄煙梗發酵產白僵菌的最佳條件為：蛋白胨1.21%，酵母粉1.03%，培養時間9.40 d時，白僵菌孢子產量預測最優值為1.17×1010個/g。以此條件進行發酵試驗，得到實際孢子產量為1.13×1010個/g（3次重復平均值），擬合度達到96.58 %，表明通過響應面法對發酵廢棄煙梗產白僵菌工藝條件的優化合理而有效，具有實際意義。

3 討 論

本試驗利用廢棄煙梗作為固態發酵白僵菌的主要基質，通過添加適量的葡萄糖作為碳源，適量蛋白胨和酵母粉作為有機氮源，NH4NO3為無機氮源補充營養，并添加無機鹽NaH2PO4、MnSO4、FeSO4作為礦質元素促進白僵菌孢子的萌發和產量的提高。通過Plackett-Burman試驗篩選出對白僵菌孢子產量影響最顯著的3個因素：培養時間、蛋白胨和酵母粉含量。其中培養時間對白僵菌孢子產量的影響度和模型貢獻率最高，表明廢棄煙梗發酵培

養基可以為白僵菌的生長提供充足的營養，在一定范圍內隨著培養時間的延長，孢子產量呈現增加趨勢，但考慮到過程中孢子產量、變化幅度以及工業生產成本等方面，應根據實際情況進行適當的控制。接種量是與發酵培養基利用率直接相關的參數，高的接種量盡管可以使菌體生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養而無法提高孢子產量；而接種量太低則會造成營養利用不充分，導致發酵周期的延長，染菌機率增高[26]，本試驗中接種量的大小對白僵菌孢子產量的提高沒有明顯的促進作用，表明煙梗中營養成分豐富，可以滿足白僵菌的生長，而且接種量過高也會增加生產成本，因此選用5%的接種量進行后續試驗，結果表明白僵菌生長情況良好，孢子產量較高，因此在本試驗中不需要補充額外的糖類，而且糖類含量過高易使發酵前期產酸增加，導致發酵基質pH降低，不利于白僵菌的生長。氮素是真菌合成核酸、氨基酸、細胞質和蛋白質的主要物質，有機氮源蛋白胨和酵母粉比無機氮源NH4NO3更適合白僵菌的生長，氮源的添加可以改善煙梗發酵培養基的碳氮比，提高發酵性能，提升產品品質[27]。在白僵菌的生長中，許多礦質元素都直接參與細胞的組成、能量的轉移、維持原生質的膠質體系和滲透性，對菌體生長起著重要的作用[28]。本試驗中NaH2PO4、MnSO4、和FeSO4的影響度和模型貢獻率均較低，對孢子產量的提高影響不大，表明煙梗中無機鹽的種類和含量豐富，在固態發酵白僵菌的過程中不需要補充額外的無機鹽。

4 結 論

通過響應面優化，綜合分析得到廢棄煙梗發酵產白僵菌的最佳工藝條件為：發酵溫度28 ℃，起始pH 6.0，m（煙梗）∶m（水）=1∶3.5，蛋白胨1.21 %，酵母粉1.03 %，培養時間9.40 d。在此條件下，白僵菌產孢量理論值為1.17×1010個/g，實際孢子產量為1.13×1010個/g，擬合度達到96.58 %。本研究探究并優化了廢棄煙梗固態發酵白僵菌的工藝條件，顯著提高了白僵菌產孢量，為廢棄煙梗的資源化利用、煙草生物防治領域的后續研究和開發提供理論

依據與技術支持。

參考文獻

[1] 路楊，徐文靜，隋麗，等. 球孢白僵菌植物內生性及其應用研究進展[J]. 東北農業科學，2016，41（1）：73-77.

LU Y， XU W J， SUI L， et al. Beauveria bassiana： endophytic colonization and applications in plant protection[J]. Journal of Northeast Agricultural Sciences， 2016， 41（1）： 73-77.

[2] JACKSON M A， DUNLAP C A， JARONSKI S T. Ecological considerations in producing and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol[J]. Biocontrol， 2010， 55（1）： 129-145.

[3] UGINE T A， WRAIGHT S P， SANDERSON J P. Microbial biological control potential of three strains of Beauveria bassiana s. l. against greenhouse shore fly Scatella tenuicosta： Assessment of virulence， mass production capacity， and effects on shore fly reproduction[J]. Biological Control， 2013， 65（3）： 348-356.

[4] OWNLEY B H， GRIFFIN M R， KLINGEMAN W E， et al. Beauveria bassiana： endophytic colonization and plant disease control[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2008， 98（3）： 267-270.

[5] SMITH S M， MOORE D， KARANJA L W， et al. Formulation of vegetable fat pellets with pheromone and Beauveria bassiana to control the larger grain borer， Prostephanus truncatus （Horn）[J]. Pesticide Science， 1999， 55（7）： 711-718.

[6] 劉晨，朱耿平，陳易彤，等. 球孢白僵菌和綠僵菌對日本雙棘長蠹林間防治效果的研究[J]. 環境昆蟲學報，2015，37（2）：343-347.

LIU C， ZHU G P， CHEN Y T， et al. Study on the field management of Sinoxylon japonicum using Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae[J]. Journal of Environmental Entomology， 2015， 37（2）： 343-347.

[7] 張龍娃，康克，劉玉軍，等. 美國白蛾高毒力球孢白僵菌菌株篩選[J]. 昆蟲學報，2016，59（1）：111-118.

ZHANG L W， KANG K， LIU Y J， et al. Evaluation of Beauveria bassiana isolates as potential agents for control of Hyphantria cunea （Lepidoptera： Arctiidae） [J]. Acta Entomologica Sinica， 2016， 59（1）： 111-118.

[8] LOPEZ D C， SWORD G A. The endophytic fungal entomopathogens Beauveria bassiana and Purpureocillium lilacinum enhance the growth of cultivated cotton （Gossypium hirsutum） and negatively affect survival of the cotton bollworm （Helicoverpa zea）[J]. Biological Control， 2015， 89： 53-60.

[9] QAZZAZ F Q， AL-MASRI M I， BARAKAT R M. Effectiveness of Beauveria bassiana Native isolates in the biological control of the med-iterranean fruit fly （Ceratitis capitata）[J]. Advances in Entomology， 2015

（3）： 44-55.

[10] DAVARI B， LIMOEE M， KHODAVAISY S， et al. Toxicity of entomopathogenic fungi， Beauveria bassiana and Lecanicillium muscarium against a field-collected strain of the German cockroach Blattella germanica （L.） （Dictyoptera： Blattellidae）[J]. Tropical Biomedicine， 2015， 32（3）： 463-470.

[11] 張璐璐. 防治西花薊馬的球孢白僵菌液固雙相發酵條件優化[D]. 北京：中國農業科學院，2016.

ZHANG L L. Optimization of liquid solid biphasic fermentation conditions for Beauveria bassiana in the control of Frankliniella occidentalis[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2016

[12] BRI?KI， F， GOMZI Z， HORGAS N， et al. Aerobic composting of tobacco solid waste[J]. Acta Chimica Slovenica， 2003， 50（4）： 715-729.

[13] 龍章德，陳皓睿，劉鴻，等. 利用果膠降解菌塔賓曲霉GYC 501改善梗絲品質及其發酵條件的優化[J]. 江西農業學報，2017，29（2）：95-98.

LONG Z D ， CHEN H R， LIU H， et al. Application of pectin-degrading fungus Aspergillus tubingensis GYC 501 in improvement of tobacco cut-stem quality and optimization of its fermentation conditions[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2017， 29（2）： 95-98.

[14] 尚善齋，雷萍，吳恒，等. 造紙法煙草薄片的研究進展[J]. 紙和造紙，2015，34（4）：45-49.

SHANG S Z， LEI P， WU H， et al. Progress on the research of paper-making tobacco sheet[J]. Paper and Paper Making， 2015， 34（4）： 45-49.

[15] ZHAO D， DAI Y， FENG G， et al. Chemical composition and fiber morphology of tobacco stem， scrap and dust[J]. Tobacco Science & Technology， 2016， 49（6）： 36-44.

[16] ZHENG Y X， WANG Y L， PAN J， et al. Semi-continuous production of high-activity pectinases by immobilized Rhizopus oryzae using tobacco wastewater as substrate and their utilization in the hydrolysis of pectin-containing lignocellulosic biomass at high solid content[J]. Bioresource Technology， 2017， 241： 1138-1144.

[17] 孫平，湯朝起，王軍，等. 煙梗人工醇化過程中主要化學成分的變化[J]. 煙草科技，2014，47（4）：50-54.

SUN P， TANG Z Q， WANG J， et al. Variation of main chemical components in tobacco stem during artificial aging[J]. Tobacco Science & Technology， 2014， 47（4）： 50-54.

[18] 趙德清，戴亞，馮廣林，等. 煙梗、煙葉碎片和煙末的化學成分與纖維形態[J]. 煙草科技，2016，49（3）：91-98.

ZHAO D Q， DAI Y， FENG G L， et al. Chemical composition and fiber morphology of tobacco stem， scrap and dust[J]. Tobacco Science & Technology， 2016， 49（3）： 91-98.

[19] ZHENG Y， WANG Y， ZHANG J， et al. Using tobacco waste extract in pre-culture medium to improve xylose utilization for l-lactic acid production from cellulosic waste by Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology， 2016， 218： 344-350.

[20] 王姣，陳彥好，張向磊，等. 廢棄煙梗提取液為基質的產油脂酵母菌的篩選與鑒定[J]. 煙草科技，2015，48（8）：15-19.

WANG J， CHEN Y H， ZHANG X L， et al. Screening and identification of oleaginous yeasts from fermentation of tobacco stem extract[J]. Tobacco Science & Technology， 2015， 48（8）： 15-19.

[21] 李超，杜雷，席宇，等. 煙梗廢料液態發酵生產蘇云金芽孢桿菌的適宜條件篩選[J]. 煙草科技，2011（3）：69-76.

LI C， DU L， XI Y， et al. Producing Bacillus thuringiensis by liquid state fermentation of waste stem[J]. Tobacco Science & Technology， 2011（3）： 69-76.

[22] 郭大城，張可可，董貴彬，等. 深紅酵母JLC固態發酵廢棄煙梗制備類胡蘿卜素研究[J]. 天然產物研究與開發， 2015，27（2）：232-235.

GUO D C， ZHANG K K， DONG G B， et al. Carotenoids production by Rhodotorula rubra JLC under solid state fermentation of waste tobacco stems[J]. Natural Product Research and Development， 2015， 27（2）： 232-235.

[23] 沈萍，陳向東. 微生物學實驗[M]. 第4版. 北京：高等教育出版社，2007.

SHEN P， CHEN X D. Microbiology experiment[M]. 4th ed. Beijing： Higher Education Press， 2007.

[24] SHEN L， MORRIS M D. Augmented Plackett–Burman designs with replication and improved bias properties[J]. Journal of Statistical Planning & Inference， 2016， 179： 15-21.

[25] FATIMA B. Plackett Burman Design[M]. Holland： Elsevier Science Publishers B. V， 2014.

[26] 李華祥. 高產孢白僵菌的發酵與茶葉病害蟲防治[D]. 無錫：江南大學，2012.

LI H X. Fermentation of Beauveria bassiana in control of tea pests[D]. Wuxi： Jiangnan University， 2012.

[27] 張亞平. 防治薊馬的白僵菌營養和發酵條件研究[D]. 北京：中國農業科學院，2014.

ZHANG Y P. Study on the nutrition and fermentation conditions of Beauveria bassiana in control of Frankliniella occidentalis[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2014

[28] 朱靜. 球孢白僵菌適應環境pH變化及胞內pH穩態維持的遺傳分子基礎及其對生物防治潛能的貢獻[D]. 杭州：浙江大學，2016.

ZHU J. Genetic molecular basis of adaptation to change of environmental pH and homeostasis of intracellular pH and its contribution to biocontrol potential of Beauveria bassiana[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2016.