化學發光微粒子免疫法檢測蝦肉中磺胺類藥物的殘留

汪善良　程茹　鐘新敏

摘要[目的]通過對比化學發光微粒子免疫分析法（CMIA）和高效液相色譜-質譜法對蝦肉中磺胺類藥物檢測結果的差異，驗證公司自研的磺胺類藥物化學發光免疫試劑盒的檢測效果。[方法]以蝦肉為檢測原料，采用直接競爭CMIA法對試劑盒進行靈敏度、特異性、精密度、準確度試驗。[結果]試劑盒檢測靈敏度為1.04 μg/kg、加樣回收率為95.25%～104.50%，變異系數（CV）均小于15%；試劑盒檢測結果與儀器分析的陰、陽性結果接近。[結論]該方法檢測結果穩定、可靠，達到國家相關標準，表明該款試劑盒可滿足動物組織中磺胺類藥物的快速檢測需求。

關鍵詞蝦肉；化學發光微粒子免疫法；高效液相色譜-質譜法；磺胺類藥物

中圖分類號S859.84文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）08-0170-04

Detection of Sulfonamides Residues in Shrimp by Chemiluminescence Microparticle Immuno Assay（CMIA）

WANG Shanliang， CHENG Ru，ZHONG Xinmin et al

（Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.， Ltd.， Guiyang Guizhou 550009）

Abstract[Objective]To verify the test effect of the companys production of sulfonamides chemiluminescence microparticle immuno assay（CMIA）detection kit， the method of chemiluminescent microparticle immuno assay and high performance liquid chromatographymass spectrometry was used to detect the residues of sulfonamides in shrimp samples， and compared the difference between the two methods of test results. [Method]Shrimp meat as raw material for detection， the kits about sensitivity， specificity， precision and accuracy were tested by direct competitive CMIA method. [Result]The sensitivity of the kit was 1.04 μg/kg， the average recovery was 95.25%-104.50%， the coefficient of variation CV all were less than 15%； The results for shrimp by CMIA method were well consistent with as the results of HPLCMS method.[Conclusion]The results for shrimp by CMIA method are stable and reliable， and meet the relevant national standards. It shows that this kit can meet the requirements of rapid detection of sulfonamides in animal tissues.

Key wordsShrimp；Chemiluminescent microparticle immuno assay（CMIA）；High performance liquid chromaloagraphymass spectrometry（HPLCMS）；Sulfonamides

基金項目2017年貴州省工業和信息化發展專項資金計劃項目（2017002）；2016年貴陽市經濟技術開發區科學技術計劃項目；2016年貴州省技術創新項目；2016年貴州省科技廳社會攻關計劃項目（黔科合〔2016〕支撐2908號）；2017年貴州省科技支撐項目（黔科合支撐〔2017〕2034）；貴陽市2016年人才創新創業資助項目（筑人才辦合同字〔2016〕第13號）。

作者簡介汪善良（1979—），男，貴州貴陽人，高級工程師，從事食品安全快速檢測技術的研究與開發工作。*通訊作者，碩士，從事農產品質量安全檢測技術應用研究。

收稿日期2017-11-16；修回日期2017-12-05

含有特征結構為對氨基苯磺酰胺結構的一類物質可統稱為磺胺類藥物，該藥物是獸醫臨床上常用的藥物，被廣泛用于預防和治療細菌感染性疾病和原蟲病等[1]，但也存在嚴重的副作用，不合理使用很容易在動物組織中造成殘留，從而對人類的健康產生潛在的危險[2]。農業部第235號文件規定，磺胺類藥物殘留量總量限量為100 μg/kg[3]，人體若長期累積過量會產生排尿及造血紊亂、過敏等危害[4]，同時會導致體內細菌對其產生抗藥性，并伴隨潛在的致癌性[5]。

磺胺類藥物目前常規的檢測方法是微生物學法，更為精準的分析方法則是儀器分析和免疫法。微生物法因耗時、精度和靈敏度低而無法定量分析使其應用受限；儀器分析方法雖然準確、靈敏，但均存在前處理程序繁雜、操作專業性強等諸多弊端而使得此類方法應用受限。免疫法主要包括酶聯免疫法和化學發光微粒子免疫法（CMIA）等，該法因具有操作簡單、靈敏度高、成本低、可批量檢測等優勢，可廣泛應用[6-10]。

筆者采用化學發光微粒子免疫分析法對蝦肉中11種磺胺類藥物進行測定，通過與儀器分析對比，以驗證貴州勤邦食品安全科學技術有限公司研制的化學發光免疫試劑盒檢測水平是否達到國家標準，從而為蝦肉的快速檢測提供符合要求的檢測手段。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。

蝦肉，購于當地超市，取蝦身中間部位。

11種磺胺類藥物標準品，純度>99.6%，美國Sigma公司；甲酸（優級純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、正丙醇（分析純）等，以上試劑均來自于貴州嘉潤試劑有限公司。

磺胺類藥物化學發光微粒子免疫分析測定試劑盒，由貴州勤邦食品安全科學技術有限公司自主研發。

1.1.2主要儀器與設備。

磁免疫全自動化學發光檢測儀，由貴州勤邦食品安全科學技術有限公司自主研發；液質聯用儀（LC-MS）（TSQ Quantum Ultra），美國Thermo；QL-901渦旋儀，廈門市?？祪x器有限公司；FSH-Ⅱ 型高速電動勻漿機，江蘇中大儀器廠；DSY-111氮吹儀，上海喬躍電子科技有限公司；HT-200 B恒溫振蕩器，金壇市城西春蘭實驗儀器廠；TG16-WS高速離心機，常州市金壇高科儀器廠；微量移液管（單道20～200 μL，100～1 000 μL），美國Thermo 公司；CPA225D電子天平（0.01 mg），江蘇明德儀器電子科技有限公司。

1.2方法

1.2.1化學發光微粒子免疫法檢測原理。

化學發光微粒子免疫法采用直接競爭原理，首先在磁免疫全自動化學發光檢測儀反應杯中依次加入預處理好的蝦肉樣品、已標記了的磺胺類藥物半抗原、已包被單克隆抗體的磁性顆粒。在含有3種物質的反應杯中，蝦肉中所含有的磺胺類藥物與酶標記抗原形成競爭關系，共同爭奪磁性顆粒上的磺胺類藥物抗體并與之結合?？乖贵w完成結合過程后，反應杯則被置于磁性分離區域，使得反應杯中與固相未結合的物質被分離，之后將化學發光底物加入其中。

用光子計數儀測定反應杯中各孔的光子計數值，這一數值的大小與磺胺類藥物濃度呈良好的負相關，通過標準曲線，再根據物質實際的稀釋倍數，即可進一步計算出蝦肉樣品中殘留磺胺類藥物的含量。

1.2.2蝦肉前處理。

取1支50 mL經清洗、滅菌的離心管，依次加入已經破碎均質處理的蝦肉（2.0±0.05）g、50 μL 0.1 mol/L 氫氧化鈉、3.8 mL乙腈、2.0 mL乙酸乙酯，渦動混勻，在室溫（20～25 ℃）條件下，以3 000 r/min的轉速離心5 min；精確移取3 mL離心后上層有機相加入到10 mL已經滅菌處理的玻璃管，將其置于50～60 ℃水浴氮氣流中吹干，之后精確加入正己烷1.0 mL，渦動60 s，再加復溶液1.0 mL，再渦動60 s，于室溫（20～25 ℃）條件下，以3 000 r/min的轉速離心5 min；除去上部有機相，取下層水相留待分析。

1.2.3蝦肉中磺胺類藥物的測定。

試驗前，需保證所有試驗所用試劑回溫至20～25 ℃，且不起泡。從試劑盒內取出2個反應杯，將磺胺類藥物的標準品和蝦肉樣品對應反應杯進行各自相應編號，各做3個平行，記錄各自位置，依次加入磺胺類藥物標準品和樣品各20 μL、酶標抗原100 μL、磁標抗體50 μL，蓋板膜蓋板后于25 ℃下避光靜置30 min。取下蓋板膜，用吸水紙吸干各孔中的液體，繼而在各孔中加入250 μL洗滌工作液，每間隔10 s清洗1次，重復5次左右，直至清洗干凈，最后用吸水紙拍干。

在各孔中各加入100 μL已制備好的發光底物工作液，進行覆膜處理后于37 ℃條件下避光孵育15 min，再按照每孔50 μL的用量加入終止液，混勻，設置反應杯于波長450 nm處，即刻完成測定。

1.2.4蝦肉中磺胺類物質含量的測定。

百分吸光率的計算。標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本對應吸光度值的平均值（雙孔）除以第1個標準品（0標準）的吸光度值的平均值，再乘以100%[9]，即：

百分吸光率（%）=B/B0×100% （1）

式中，B為磺胺類藥物標準品或蝦肉溶液的平均吸光度值；

B0為1 μg/mL標準溶液的平均吸光度值。

標準曲線的繪制與蝦肉樣本磺胺類藥物濃度的計算。

分別對0、1、3、9、27、81 μg/L 6 個濃度梯度的標準液進行化學發光微粒子免疫法測定，以標準品百分吸光率測定值為縱坐標，磺胺類藥物標準品濃度（10-9）的對數為橫坐標，繪制磺胺類藥物的標準曲線圖，計算回歸方程及相關系數，根據線性方程計算IC50。將所測定蝦肉樣本的百分吸光率測定值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本的實際濃度。

1.2.5磺胺類藥物化學發光測定試劑盒指標檢測方法。

1.2.5.1靈敏度。

評價免疫法試驗反應靈敏度常用IC50值和最低檢測限表示，IC50值即為零標準溶液吸光度值的50%處對應的藥物濃度，兩者數值的大小與試劑盒的靈敏程度成反比。樣品采集地區、種類、預處理方法等因素與最低限檢測有較強的關聯性，而IC50則不受樣本本身的影響，值相對不變[11]。兩者結合，可用于試驗所用試劑盒靈敏度指標的評價。

分別檢測20組空白蝦肉樣品，計算其所含磺胺類藥物的濃度，檢測限LOD=S+3SD（其中S為磺胺類藥物的濃度平均值，SD為標準差），根據下面公式（2）計算磺胺類藥物化學發光測定試劑盒檢測實際樣品的最低檢測限。

LOD=X+3nX2-（X）2n（n-1）（2）

式中，X為試驗重復測定空白樣品的平均值；

n為試驗測定樣品數量。

1.2.5.2特異性。

特異性用交叉反應率表示，其是衡量抗體與各抗原決定簇結合能力強弱的指標，試驗用一定濃度范圍的磺胺類藥物類似物取代磺胺類藥物標準溶液，測定其標準曲線，計算各藥物交叉反應率[12]。交叉反應率（%）=引起50%抑制的磺胺甲噁唑濃度/引起50%抑制的磺胺類似物濃度。

1.2.5.3精密度、準確度。

精密度是反映測定方法對某一特定樣品重復測定所得結果的一致程度的指標，其是評定化學發光試劑盒質量最為基本的參數；準確度是試驗測定值與真實值間的符合性程度的指標，這一指標大小是通過樣品回收率計算所得[13]。

試驗檢測為陰性的蝦肉樣本以2.0、4.0、8.0 μg/kg的添加量進行磺胺類藥物的添加，各設6個平行，根據試劑盒設計方法進行測定操作，計算樣品的回收率。

1.2.5.4磺胺類藥物化學發光測定試劑盒與儀器檢測結果比較。

準備20份隨機抽取的市場在售的蝦肉樣本，分別進行試劑盒和儀器檢測結果對比。試劑盒檢測方法根據試劑盒說明書步驟進行操作，高效液相色譜-質譜法儀器檢測分析則參考《GBT 21316—2007 動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質譜法》（動物組織中磺胺類藥物的檢出限為50 μg/kg）進行操作[13]。

2結果與分析

2.1標準曲線

從圖1中可得，標準曲線回歸方程為y=-36.56 x+77.156，方程相關系數R2=0.996 2，說明該試劑盒線性關系良好。

2.2磺胺類藥物化學發光試劑盒靈敏度的測定

由表1可知，磺胺類藥物化學發光快速檢測試劑盒標準曲線IC50值的變化范圍為3.52～4.59 μg/L，IC50平均值4.04 μg/L。對空白蝦肉樣品進行20次檢測，結果見表2。由表2可知，試驗所用試劑盒對空白蝦肉的最低檢測限為1.04 μg/kg，供試樣品平均值0.63 μg/kg，標準差0.14。綜合以上2個數據可以得出，該試劑盒靈敏度高。

2.3磺胺類藥物化學發光試劑盒特異性的測定

磺胺類藥物化學發光試劑盒特異性測定結果如表3所示，試驗所用11種抗體對磺胺類似藥物的交叉反應率均較低，其中對磺胺二

甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶交叉反應率均極低。綜上，得出該試劑盒具有較好的特異性。

2.4磺胺類藥物化學發光試劑盒準確度及精密度的測定

在空白蝦肉樣品中，將磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺間甲氧嘧啶、酞?；青邕?、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶11種磺胺類藥物分別以2、4、8 μg/kg 3個濃度進行添加，每個藥物濃度各設置5組平行試驗，依照試劑盒提供的步驟方法進行蝦肉樣品測定，每組試驗重復進行3次，分別計算變異系數和回收率，試驗測定結果見表4。從表4中可知，蝦肉樣品的加樣回收率范圍在95.25%～104.50%，且變異系數均小于15%。與《農業部文件》農醫發〔2005〕17號附件2中有關試劑盒備案相關標準相符。

2.5磺胺類藥物化學發光試劑盒與儀器檢測結果比較分析

2種分析方法測定結果見表5，以50 μg/kg為陽性判定線，當樣品實際檢測結果低于這一判定線，則以“—”表示，高于或等于時則以實際測定值表示。從表5的檢測結果中可得：2種手段所得檢測結果相近，從4號樣品的檢測結果驗證，試劑盒的檢測限較儀器更低，更易檢測出磺胺藥物低殘留的樣品。由此可知，該試劑盒法的檢測符合國家檢測標準且優于儀器檢測。

3結論與討論

該試驗采用的化學發光免疫試劑盒測定蝦肉中11種磺胺類藥物，通過對其檢測方法進行驗證，并進一步將試劑盒檢測結果與儀器檢測進行對比。結果顯示，試劑盒標準曲線IC50值的波動范圍為3.52～4.59 μg/kg，試劑盒檢測靈敏度為1.04 μg/kg、交叉反應率回收率為95.25%～104.50%，變異系數均小于15%，對樣品的檢測限低且遠低于國家最高限量，表明該款化學發光免疫試劑盒靈敏度高、特異性強、準確度和精密度均較高，檢測結果與儀器分析結果接近。

該款化學發光免疫檢測試劑盒配套磁免疫全自動化學發光檢測儀檢測樣品測試速度高達120 測試/h，可實現連續不間斷進樣，從加樣到測試整個環節高度自動化，具有操作簡單、能耗低、設備投入少等優勢，符合動物源性食物中磺胺類殘留物的快速檢測需求。

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