無綠藻的微生物學特性和菌種鑒定

楊金 章強強

(復旦大學附屬華山醫院皮膚科，上海 200040)

無綠藻感染引起的無綠藻病是一種較罕見疾病，自1964年Davies[1]首次報道1例中型無綠藻 (Protothecazopfii)所致的皮膚無綠藻病以來，全球范圍內已有190例文獻報道，其中近1/3的無綠藻病例在最近10年內被報道，說明無綠藻病發病率有升高趨勢。雖然無綠藻作為病原體在人群中發病機制尚不完全清楚，然而發病率的升高可能和免疫功能低下人群的增多有關[2]。為提高對無綠藻這一條件致病真菌的認識，以期對無綠藻病的診治有進一步探索，本文對無綠藻的微生物學特性和鑒定方法進行簡要綜述。

1 分類學

從1894年Kruger首次分離出無綠藻[3]以來，無綠藻的分類一直受到爭議。最初，根據在沙氏培養基培養后的酵母樣外觀，無綠藻被歸為真菌，然而無綠藻既不能和酵母也無法和更低級別的藻類植物聯系起來。1913年Chodat[4]根據無綠藻和小球藻相同的無性繁殖生成內孢子的繁殖方式，重新將其歸于藻類。1930年Asdforth等[5]從熱帶口炎性腹瀉的病例中分離出Protothecazopfii和P.portoricensisvar.trisporus，并確定這種生物可以在合成培養基上生長。Ciferri[6]在1957年將無綠藻重新歸為酵母菌。目前普遍認為，無綠藻在進化過程中一定程度上由小球藻發育而來，同時在細胞壁組成、生理學和抵抗外界環境壓力的能力有所不同[7-8]。無綠藻細胞壁含有的孢粉素是一種穩定的生物高聚物，使其可以抵抗機械壓力、物理化學因素以及酶降解[9]?；诩毎诘奶卣?，目前無綠藻在生物學分類中處于真核生物 (Eukaryota)、綠色植物界 (Viridiplantae)、綠藻門 (Chlorophyta)、Trebouxlophyceae綱、綠藻目 (Chlorellales)、綠藻科 (Chlorellaceae)、無綠藻屬 (Prototheca)[2]。

在過去，只有3種無綠藻被識別：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)和小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)[10]。然而從人和動物身上分離的幾株菌株測序核糖體RNA結果顯示，先前描述的中型無綠藻變種可能是不同的種類。中型無綠藻基因1型通常在牛糞中發現，然而大多數牛乳腺炎是由中型無綠藻基因2型導致。從豬糞而非牛糞中分離的中型無綠藻基因3型，被重新命名為Protothecablaschkeae。最近Kazuo等[11]在一位患者感染皮膚上得到的活檢標本，通過組織病理和微生物培養發現并分離出一種新的無綠藻。通過分子鑒定等技術確定該菌株和小型無綠藻和小球藻有較近的系統發育關系，是無綠藻屬的新種類，提出Protothecacutissp.nov。目前，普遍認為無綠藻屬包括6個種：大型無綠藻 (Protothecastagnora)、中型無綠藻 (Protothecazopfii)、小型無綠藻 (Protothecawickerhamii)、Protothecaulmea、Protothecablaschkeae及Protothecacutis[12]。

2 流行病學

無綠藻廣泛存在于自然界，通常能從植物表面、土壤或者水源中分離出，也可能暫時以菌落的形式存在于人或動物的消化道，有時定植在人體皮膚和甲床而無臨床表現。然而因為無綠藻的腐生性質，它們更傾向于污水、牲畜糞液等潮濕環境來持續獲得可供降解的有機物[10]。

無綠藻導致的無綠藻病是一種罕見、散發疾病。人、犬、貓及非家養哺乳動物均可能感染[13]。人類無綠藻的感染較多由小型無綠藻導致[14-15]，中型無綠藻感染的病例也有報道[15]，最近發現的P.cutis也能引起人感染造成皮膚損害[11]。其他幾種無綠藻主要導致動物感染，如牛乳腺炎。具體菌種致病性及臨床表現見表1。

表1 無綠藻與疾病表現

注：C.皮膚,M.乳腺炎,O.鷹嘴滑膜炎,S.系統感染

3 真菌形態與結構特征

無綠藻與酵母菌外形相似，呈球形、橢圓形甚至腎型，是直徑3～30 μm不等的單細胞微生物。無綠藻不含細菌特有的胞壁酸及真菌特有的葡糖胺[16-17]，缺乏葉綠體，電鏡下觀察可見細胞壁僅兩層。無綠藻進行無性繁殖，孢子囊是無綠藻屬的主要結構，大約2～20個內生孢子從一個孢子囊中逐漸發育長大并隨著孢子囊的破裂被動釋放出來[18]。不同種類無綠藻的孢子囊直徑不同[19]，大型無綠藻孢子囊直徑7～14 μm，中型無綠藻7～30 μm，小型無綠藻3～10 μm。小型無綠藻的孢子囊為桑葚狀，有多分隔結構，內孢子呈對稱排列。其他類型無綠藻不形成多分隔結構，而是表現為隨意的不規則分隔[2]。無綠藻培養適溫在25～30℃之間，需氧或微需氧[20]。一般菌落形態為潮濕、灰白色乳酪樣，鏡下結構呈圓形或橢圓形孢子，壁厚、無菌絲及芽孢，內含特征性內孢子。

4 藥物敏感性

無綠藻體外藥敏實驗，至今尚無美國臨床實驗室標準化研究所 (CLSI)的標準、質控及MIC折點，因此只能從已經發表的實驗結果和數據中總結無綠藻菌對不同種類藥物的敏感性。

體外藥敏實驗均發現無綠藻屬對兩性霉素B敏感[21-24]，這一結果也與臨床實際治療情況相符。Todd等[25]通過分析160例患者所接受的167種可評估治療方案，發現靜脈注射兩性霉素B臨床上最常用且效果最好，治療成功率為77%；章強強等[26]報道的1例小型無綠藻所致腦膜炎病例中，使用兩性霉素B治療也獲得了良好療效。兩性霉素B或其脂質體成為現今國外一線治療無綠藻病方案之一。其次，體外藥敏實驗顯示兩性霉素B和四環素對抑制無綠藻屬有協同作用[27]，臨床上兩藥聯合治療取得成功[28]。

無綠藻對不同唑類藥物敏感性不同，不同種無綠藻對同一唑類藥物敏感性也有差別。在近10年的49例藥敏實驗結果報道，對伊曲康唑敏感的有17例，其中中型無綠藻2例[29-30]，小型無綠藻15例；對酮康唑敏感的2例，均為小型無綠藻。Linare[15]測定了104株無綠藻，顯示其對伏立康唑均敏感，MIC≤0.5 μg/mL。中型無綠藻和小型無綠藻對咪康唑敏感，其他型無綠藻則未發現對咪康唑的敏感性。無綠藻對唑類藥物以及多烯類藥物的敏感性可能是因為其細胞膜中性脂質部分存在麥角固醇[31]，特別是小型無綠藻，麥角固醇的含量達到4%。此外，無綠藻對咪唑類的藥物敏感型呈現出顯著差別，細胞膜中游離脂肪酸含量的不同可能是其根本原因[2]。

抗細菌藥物中，無綠藻對氨基糖苷類抗生素 (阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、鏈霉素、妥布霉素)較敏感[32]。近年來國外研究者所做的藥敏實驗已經證實慶大霉素、卡那霉素對無綠藻的有效性[32-36]，其中慶大霉素的MIC在0.3～0.9 μg/mL之間。最近Morandi[32]報道奈替米星顯示出對無綠藻良好的抑制性，實驗中奈替米星對無綠藻的MIC50為12 μg/mL，MIC90為24 μg/mL,且對于不同種無綠藻的MIC均相同。乳酸鏈球菌肽是由乳酸乳球菌產生的一種具有廣譜抗菌作用的細菌素。Morandi等[32]通過體外藥敏實驗發現大部分中型無綠藻菌對不同濃度的乳酸鏈球菌肽敏感。

雖然各種體外藥敏實驗結果存在差異，但綜合所有實驗數據，無綠藻屬對于5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、磺胺類藥物、β-內酰胺類抗生素、萬古霉素、紅霉素、氯霉素等是耐藥的。

5 常用鑒定方法

無綠藻的分型鑒定主要通過直接鏡檢、真菌培養以及組織病理學，近年來隨著分子生物技術的迅猛發展，分子生物學鑒定成為無綠藻分型鑒定的重要手段，下面分別敘述。

5.1 直接鏡檢

10%氫氧化鉀溶液制片直接鏡檢，可見大量圓形、卵圓形或橢圓形孢子，大小不一，菌體透明，壁厚、無菌絲、芽孢及芽生現象，內含特征性內孢子。吳紹熙等[37]報道的由中型無綠藻引起的皮膚無綠藻病，皮損直接KOH涂片可見成團的圓形或卵圓形單壁發亮不出芽孢子，直徑1.3～11 μm，有時可見多個直徑為4～5 μm的內孢子。在組織病理學顯示皮下結節內有大量圓形或橢圓形孢子，壁厚，內有1～8個分隔。真菌直接鏡檢不能區分具體種。

5.2 真菌培養

常規培養條件下，肉眼觀察菌落形態呈潮濕、灰白色乳酪樣。中型無綠藻菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶；小型無綠藻最適生長溫度為30℃，菌落呈半球形，邊緣光滑，細胞形態和中型無綠藻相似但是更??；大型無綠藻因為產生莢膜，菌落呈黏液樣，表面平坦，邊緣光滑，和小型無綠藻及中型無綠藻不同，大型無綠藻在37℃不能較好生長只能在30℃生長[2]；P.blaschkeae菌落表面平坦，中央紐扣狀，邊緣皺褶。此外，在章強強等[26]報道的1例小型無綠藻引起的腦部感染病例中，小型無綠藻在念珠菌顯色平皿 (CHROMagarCandida)上形成粉紅色菌落。

5.3 組織病理學

組織病理學檢查常顯示不同的形態，可表現為嚴重的肉芽腫樣壞死或無任何炎癥改變。大部分為炎性肉芽腫伴壞死；各種炎性細胞、組織細胞混合浸潤；角化過度及假上皮瘤樣增生；局灶性角化不全；淋巴樣組織增生；可在表皮或真皮乳頭層中部及其他感染組織中發現孢子囊。在系統性無綠藻病中還可出現嗜酸性粒細胞增多癥及膽囊、十二指腸和肝門等感染部位的纖維性變[2]。PAS染色可清晰分辨病原菌的形態與結構，也可采用Gridley真菌染色法 (Gridley fungus stain)或Grocott-Gomori六胺銀改良法。無綠藻組織病理學特征為孢子囊形態:圓形、卵圓形、橢圓形，內含數個厚壁內孢子，不出芽。HE染色不明顯，PAS染色明顯可見。小型無綠藻感染組織病理可見到桑葚樣、草莓樣孢子囊，當孢子囊內有許多分隔的母細胞 (內孢子)就構成車輪狀排列，而中型無綠藻無上述特點。除了常規染色，Pal等[38]通過對分離出的致病無綠藻屬應用Narayan染色，成功顯示出其組織形態進而鑒定。

5.4 生化特性

Arnold等[39]利用蔗糖、海藻糖、乳糖、肌糖、正丙醇、木糖等作為碳源進行碳源同化實驗對無綠藻屬進行鑒定。這種生長譜法結果可靠但花費時間，一般需要2周才能明確鑒別。對海藻糖的利用可以作為鑒別中型無綠藻及小型無綠藻的主要手段：小型無綠藻可利用海藻糖但不能利用正丙醇，而中型無綠藻相反。偶爾碳源來源、純度及培養基的成分可能會給鑒定結果帶來偏差。利用藥敏特性也能幫助進行無綠藻鑒定：中型無綠藻對克霉唑 (50 μg)耐藥，而小型無綠藻對克霉唑 (50 μg)敏感[40]；對新霉素的不同敏感性可以將大型無綠藻與中型無綠藻、小型無綠藻鑒別[41]。API 20C AUX、API 50、Vitek-2酵母鑒定系統及Rapid ID Yeast Plus test等商業化酵母鑒定試劑板可幫助鑒定菌種，但近來有實驗利用經典的酵母鑒定試劑板API 20C AUX鑒定的結果與分子生物學測序結果不符，分析認為API 20CAUX可能是早年建立的數據庫，覆蓋的菌種庫相對有限，特別是隨著新的菌種及其變種或亞型不斷增多，商業化酵母鑒定試劑板有一定局限性。另外利用熒光抗體技術可以檢驗無綠藻屬的感染,但不能確定種。

5.5 分子生物學

近年來發展的分子生物學的鑒定方法可將菌株鑒定至亞種或變種[42]，且與傳統真菌學檢查方法相比，具有耗時短、客觀、可重復性好等優點。

基因序列同源性分析法 目前真菌DNA序列分析的研究幾乎都集中在核糖體DNA (rDNA)上，核糖體大亞基 (LSU)D1D2區、小亞基 (SSU)D12D2區以及核糖體內轉錄間隔序列ITS區在真菌核酸序列分析中，常用于真菌種水平的鑒定。其中LSU、ITS序列大小適中,因此在分類及鑒定中更為常用。2013年Hirose等[43]首次成功對小型無綠藻的ITS序列完整擴增，并發現ITS片段在不同菌種間差別較大，大小順序是小型無綠藻>P.blaschkeae>中型無綠藻>P.cutis。朱利平、章強強等[44]通過D1/D2序列對兩株無綠藻鑒定至種的水平，然而無法通過ITS序列進行鑒定，這可能是由其低覆蓋率和或低相似度造成。2014年Marques等[12]優化PCR條件，通過向PCR反應中添加5%DMSO，實現了完整ITS區域的穩定擴增，對14株P.blaschkeae和18株中型無綠藻2型成功鑒定，并發現中型無綠藻2型的ITS序列長度雖然相較P.blaschkeae更短，但是種內多樣性更加顯著。

基于PCR的分子技術 ①PCR-SSCP:聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性 (PCR-SSCP)是基于PCR 的單鏈構象多態性分子標記技術?；具^程是:PCR擴增靶DNA；將特異的PCR擴增產物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果。2012年Cremonesi等[45]利用此技術對50個臨床分離株成功進行鑒定，對18S rDNA基因的兩個區域PCR產物進行分析，發現不同種菌株遷移速率存在差別，由快到慢分別是中型無綠藻基因型2>中型無綠藻基因型1>P.ulmea>P.blaschkeae>大型無綠藻。雖然PCR-SSCP技術具有快速、簡單、高度重復性的優點，并可以鑒定出傳統PCR方法無法鑒定的P.ulmea和大型無綠藻，但此技術對于無綠藻的鑒定也有一定局限性，例如反應對溫度和pH較敏感及DNA片段長度的限制。②PCR-RFLP:PCR-限制性片段長度多態性 (Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP) 技術的原理是PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。這種方法對DNA 的量和純度沒有很高的要求，可簡化圖譜的帶型，易于分析[46]。2008年，Aouay等[47]利用此技術對分離自患有乳腺炎奶牛的30株中型無綠藻菌進行基因分型，結果有27株為中型無綠藻基因型2，3株為中型無綠藻基因型3 (即P.blaschkeae)，結果與基因型特異性PCR鑒定結果一致。2010 年Tomasz Jagielski等[48]利用同樣技術成功對分離自患有乳腺炎奶牛的44個無綠藻菌株進行分型。③兩步法熒光定量PCR技術/DNA分辨率溶解曲線分析 (two step Real Time PCR reaction followed by DNA Resolution Melting Analysis):Two-stepqPCR/RMA是一種快速、高通量的鑒定方法，相比于傳統的分子學鑒定更加準確、穩健、性價比高。2010年Ricchi等[49]運用此種方法成功鑒定了中型無綠藻基因型1、中型無綠藻基因型2和P.blaschkeae。然而由于全世界范圍內缺乏大型無綠藻、小型無綠藻及P.ulmea的保存培養株，第二步qPCR能否用于更多無綠藻種的鑒定有待進一步實驗。④RAPD-PCR:隨機擴增多態性DNA標記 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技術也是快速、經濟、具有高分辨能力進行無綠藻鑒定的手段之一。近期，Morandi等[32]運用RAPD技術成功將意大利、巴西兩地分離出的49株無綠藻進行種的分型。實驗中，RAPD-PCR的重現性高于90%，使用的10個引物中，M13、OPA-4和OPA-18表現出清晰、可重復的擴增能力較適合用于鑒定，這3個單引物的Simpson指數分別為0.94、0.92和0.85，三種引物聯合使用的Simpson指數為0.98。對于原核生物和真核生物，RAPD-PCR是十分實用的鑒定途徑[50]，和其他分子技術的聯合使用對于鑒定發現無綠藻新的基因型提供可能。⑤ISSR-PCR:ISSR (inter-simple sequence repeat)是一種基于微衛星序列發展起來的新的標記技術，簡便、穩定，可以鑒定基因水平上更微小的差異。Morandi等[32]在RAPD-PCR基礎上，結合ISSR技術得到了42株中型無綠藻2型間的相似系數，進一步發現同種間的分子水平差異。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF)是近年來發展起來的一種新型的軟電離生物質譜，其無論是在理論上還是在設計上都十分簡單高效，很適合對蛋白質、多肽、核酸和多糖等生物大分子研究。1996年Holland等[51]首次報道運用MALDI-TOF技術對微生物進行鑒定。2012 年J.Murugaiyan等[52]應用此項技術對290株臨床無綠藻菌株成功進行鑒定，并發現中型無綠藻和P.blaschkeae在3-20kDa范圍內顯示出特征性質譜出現高峰。J.Murugaiyan等在傳統步驟上還使用了超聲處理以提高質譜質量，同時建立主要光譜庫 (main spectra library，MSP)將這種光譜圖的可重復性進一步加強。

6 小 結

我國人口基數大、環境復雜，無綠藻病的實際發病率可能遠遠超過目前的文獻報道數，一方面是無綠藻病臨床癥狀缺乏特異性，另一方面對此菌的鑒定特征缺乏足夠認識，導致目前無綠藻病的診斷率遠低于實際感染率。隨著科技發展，技術提升，深入了解無綠藻的微生物學特性，全方位探索無綠藻的鑒定方法對于了解我國無綠藻得分布與感染在流行病學具有重要意義，也能提升我國在罕見真菌病中的診斷水平與國際地位。

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