Box-Behnken設計-效應面法優化甘草黃酮納米混懸處方

吳超群，李小芳，牟倩倩，嚴敏嘉，趙甜甜，馬祖兵

甘草黃酮是從甘草根及根莖中提取的一類具較強生理活性的脂溶性物質，具有顯著的抗炎、抗潰瘍等藥理作用，但甘草黃酮的水溶性差，嚴重制約了其的應用及發展[1-2]。納米混懸劑(nanosuspensions NS)是 20 世紀末發展起來的一種新型納米給藥系統，其主要是以少量表面活性劑為穩定劑的“純藥物”粒子構成一種亞微米膠體分散體系[3-4]。其適用范圍廣，無論是難溶于水的藥物還是既難溶于水又難溶于油的藥物均適用。納米混懸劑因處方簡單、制備快速、載藥量高、且具有靶向性等優勢成為增溶技術的研究熱點之一。本試驗采用沉淀法-高壓均質法制備甘草黃酮納米混懸劑，并采用Box-Behnken設計-效應面法對處方進行優化，以期得到工藝穩定、處方簡單、預測性及重現性良好的甘草黃酮納米混懸劑。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nicomp 380ZLS 型激光粒度分析儀 ( 美國 PSS公司 ) ；AH-100D 型高壓均質機 ( 加拿大 ATS 公司 )

1.2 材料

甘草黃酮原料藥(西安小草植物科技有限責任公司，批號XC20160508，含有量為70.0%); 十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚維酮K30（PVPK30）、泊洛沙姆188（P188）、聚乙二醇400（PEG400）、吐溫-80(成都市科龍化工試劑廠)。

2 方法與結果

2.1 甘草黃酮納米混懸劑的制備

采用沉淀法-高壓均質法制備。稱取甘草黃酮加入適量的無水乙醇，超聲使其完全溶解；勻速加入到含有穩定劑的純水溶液中，勻速攪拌15 min，旋轉蒸發揮去乙醇，即得粗混懸液，采用高壓均質機在一定的壓力下均質數次，即得甘草黃酮納米混懸劑。采用Nicomp 380ZLS 型激光粒度分析儀測定粒徑及PDI值。

2.2.1 穩定劑的篩選 根據參考文獻及預實驗[5-6]，按“2.1”項下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑、多分散指數（PDI）以及2 h后的穩定性情況為評價指標，考察了十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚維酮K30（PVPK30）、泊洛沙姆188（P188）、聚乙二醇400（PEG400）、吐溫-80等不同穩定劑對甘草黃酮納米混懸劑的影響。見表1可知，PVPK30與PEG-400聯合作為穩定劑時，制得的納米混懸劑粒徑小，體系能保持較長時間的穩定。

表1 不同種類穩定劑對甘草黃酮納米混懸劑平均粒徑和PDI的影響(n=3,±s)

表1 不同種類穩定劑對甘草黃酮納米混懸劑平均粒徑和PDI的影響(n=3,±s)

穩定劑種類 平均粒徑（nm） PDI 2h后的穩定性SDS 244.3+2.780.283+0.009 細微沉淀懸浮后沉淀于杯底PVPK30 205.9+2.110.219+0.006 絮狀聚集懸浮，搖之易分散P188 298.2+4.560.327+0.015 顆粒較大，沉淀于杯底PEG400 210+2.23 0.265+0.008 極細微粒懸浮在水中吐溫-80 272.9+4.820.378+0.021 顆粒大易產生絮凝，再分散難SDS+PVPK30301.3+6.280.389+0.017 顆粒較大，放置后沉淀于杯底PVPK30+P188289.6+5.210.312+0.025 顆粒較大，放置后沉淀于杯底PEG-400+PVPK30 200.7+3.120.189+0.006 顆粒細小，放置后能保持較長時間的穩定

2.3 單因素考察

2.3.1 乙醇用量考察 按“2.1”項下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑及PDI為評價指標，考察無水乙醇與水的體積比為1:10、1:5、2:1對甘草黃酮納米混懸劑粒徑和PDI的影響。見表2可知，隨著無水乙醇的用量增加，制得的甘草黃酮納米混懸劑的粒徑越小，但PDI隨之增大。因有機溶劑具有一定毒性，故選取無水乙醇與水的體積比為1:10。

表2 無水乙醇用量對甘草黃酮納米混懸劑的粒徑和PDI的影響結果(n=3,±s)

表2 無水乙醇用量對甘草黃酮納米混懸劑的粒徑和PDI的影響結果(n=3,±s)

無水乙醇：水 平均粒徑（nm） PDI 1:10 215.6±3.12 0.213±0.0161:5 196.5±2.76 0.315±0.0232:1 168.2±3.65 0.325±0.031

2.3.2 磁力攪拌器轉速考察 按“2.1”項下的方法制備甘草黃酮納米混懸劑，以平均粒徑及PDI為評價指標，考察了200、400、600、800、1000 r﹒min-1五種轉速對甘草黃酮納米混懸劑的影響。見圖1可知，隨著磁力攪拌器轉速的增加，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑及PDI隨之減小，這是由于高轉速能增加粒子間的碰撞機會以及強度，使得粒徑減小，但當轉速過高時，攪拌過程中可能會產生氣泡，阻礙了粒子間的碰撞，導致粒子增大[7]。故最終選取轉速為800 r﹒min-1。

圖1 磁力攪拌轉速對粒徑及PDI的影響

2.3.1 均質壓力對粒徑及PDI的影響 按2.1項下的方法制備甘草黃酮粗混懸液，將其置于50 MPa的壓力下均質3次，再分別于40、60、80、100、120、150 MPa等不同壓力下均質10次，測定平均粒徑及PDI值。見圖2可知：隨著均質壓力的升高，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑及PDI值逐漸變小，當增加到一定壓力后，又隨之增大。故選擇將粗混懸劑先在50 MPa下循環3次，再在120 MPa下循環10次。

圖2 不同均質壓力對粒徑及PDI的影響

2.3.2 均質次數對粒徑及PDI的影響 按2.1項下的方法制備甘草黃酮粗混懸液，將其置于50 MPa的壓力下均質3次，再置于120 MPa的壓力下分別均質5、10、15、20和25次取樣，測定平均粒徑及PDI值，見圖3可知：隨著均質次數的增多，甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑及PDI逐漸降低，當均質次數達到15次后，甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑及PDI值的變化不大。故綜合考慮，選擇均質次數為15次。

圖3 均質次數對粒徑及PDI的影響

2.4 甘草黃酮納米混懸劑的處方優化

2.4.1 Box-Behnken設計-效應面法設計優化處方 根據前期預實驗結果，選取甘草黃酮質量濃度（A）、PVP K30 濃度（B）、PEG-400濃度（C）為因素，以甘草黃酮納米混懸劑的平均粒徑（Y ）為相應值，響應值越小越好。采用Box-Behnken設計-效應面法設計優化甘草黃酮納米混懸劑的處方。實驗因素水平見表3，試驗安排與結果見表4。

表3 實驗因素水平表

表4 Box-Behnken試驗安排及結果

14 -1 0 1 245.215 1 -1 0 225.616 -1 0 -1 210.817 1 1 0 285.9

2.4.2 模型的擬合 應用 Design-Expert 8.0.6 軟件分析對表4試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多元回歸方程： Y =+198.36+13.16* A+23.64*B+19.48* C+5.15* A * B+3.38* A * C-18.38* B *C+23.89* A2+24.34* B2+22.92* C2（P＜0.0001）。擬合方程相關系數R2=0.9898，表明該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（P＞0.05）,表明該模型無失擬現象，可充分反映實際試驗值。綜上，該模型可對甘草納米混懸劑的處方進行分析和預測。

表5 方差分析結果

2.4.3 效應面優化與預測 根據回歸方程應用 Design-Expert 8.0.6 軟件繪制三維效應面圖，見圖4?？芍?，甘草黃酮納米混懸劑的粒徑受甘草黃酮濃度、PVPK30及PEG-400共同影響，粒徑隨著PVPK30和PEG-400的用量增加先降低后升高，隨甘草黃酮濃度的增大呈非線性增加。經以上分析，模型預測的最優處方為：甘草黃酮為10.14 mg﹒mL-1，PVPK30為2.26 mg﹒mL-1，PEG400為2.29 mg﹒mL-1，預測Y值為181.8。

圖4 三維效應曲面圖

2.4.4 最優處方驗證 按“2.4.3”項下優化所得處方，制備3批甘草黃酮納米混懸劑，測定平均粒徑及PDI值。見表5可知，預測值與實際值的偏差為1.16%，說明 Box-Behnken設計-效應面法所得到的數學模型預測性良好，適用于甘草黃酮納米混懸劑的處方優化。

表5 Box-Behnken設計-效應面法優化驗證

3 結論

通過試驗，采用 Box-Behnken設計-效應面法優選甘草黃酮納米混懸劑的最優處方。以PVPK30、PEG-400為穩定劑，采用沉淀法-高壓均質法制備甘草黃酮納米混懸劑，得到外觀均為帶乳光的棕黃色溶液，粒徑為（179.7±0.907）nm，PDI為0.274±0.012。

4 討論

納米混懸劑制備方法主要分為了Bottom-up 技術和Top-down 技術兩大類，沉淀法即采用Bottom-up技術將藥物先溶解后通過控制析晶條件聚集成納米粒子；高壓均質法采用Top-down技術借助機械力將藥物大顆粒粉碎成納米粒子。將沉淀法和高壓均質法聯合使用，不僅降低了高壓均質機堵塞狹縫的風險，防止其因硬度過大不易均質，且克服了沉淀法制得產品不均勻，易團聚的問題[8-9]。

納米混懸劑屬于熱力學不穩定體系，粒子易發生聚集以減小表明自由能。為克服粒子間的聚集，通常需加入適量、適宜的穩定劑。PVP K30是一種常用的空間穩定劑，提供立體穩定效應[10-11]。本研究采用PVPK30與PEG-400 聯合作為穩定劑制備甘草黃酮納米混懸劑。

應用Box-Behnken 效應面法優化甘草黃酮納米混懸劑處方是基于單因素試驗，可充分考慮到各個因素之間的交互作用，并對其進行非線性模型擬合，具有可信度高、預測性好等優點。

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