豬偽狂犬病毒貴州分離株gE基因的克隆及遺傳信息分析

敖清瑩，曾智勇，徐 國，楊 霞，何祥艷，何小莉，張愛瓊，咸 文，葉百川

(貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以發熱、奇癢(豬除外)、腦脊髓炎為主要特征的一種急性傳染病[1]。偽狂犬病毒能感染多種宿主，其中豬是該病毒的主要宿主，各年齡段的豬均可感染，新生仔豬主要表現為神經癥狀，還可出現腹瀉等消化系統癥狀；成年豬通常為隱性感染，主要引起妊娠母豬死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率、流產及種豬不育[2]。我國20世紀40年代末在貓中首次發現了偽狂犬病毒，60年代初在豬群中也出現了該病毒的流行。至今偽狂犬病毒仍在我國廣泛流行，嚴重威脅著我國養殖業的安全[3]。PRV屬于皰疹病毒(Herpesuiri-dae)、α-皰疹病毒亞科，基因組為線狀雙股DNA，長約150 kb，編碼70～100種蛋白質，其基因組中G+C含量最高達73%[4]。PRV的毒力由多種基因共同控制，主要有編碼胸苷激酶(TK)、糖蛋白gI、gD、gE和核苷酸還原酶(RR)等基因[5-6]，其中gE基因是該病毒復制非必需的糖蛋白[7]。此外gE基因還是PRV的病毒復制和主要毒力決定基因的非必需獨立基因，是一種能夠促進細胞融合的糖蛋白，該特性能介導病毒在細胞間的擴散[8-9]，研究表明去除糖蛋白gE可導致PRV毒力減弱[10]，所以目前市面上流通的偽狂犬疫苗大部分為gE基因缺失疫苗。自2011年開始，全國各地已免疫豬偽狂犬病病毒疫苗免疫的豬場開始頻繁發生豬偽狂犬病，對我國豬群及養豬行業造成了嚴重的經濟損失。行宇等[11]于2012～2014年對河南省豬場進行gE抗體的調查，結果表明3年來gE陽性率呈持續上升趨勢。李峰等[12]于2012～2013年對濱州及周邊地區開展豬病毒性疾病的流行現狀調查，發現2012年和2013年PRV野毒的檢出率與2011年相比顯著升高。自2012年后，我國多個省市報道PRV新流行株的分離與鑒定，但是貴州省PRV病毒分離的報道相對較少。本研究對2017年所分離的一株PRVgE基因進行TA克隆后測序，并進行序列分析，以期為豬偽狂犬病的防控以及開發新型豬偽狂犬病疫苗提供科學和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraciton Kit Ver.5.0核酸提取試劑盒、限制性內切酶、LA Taq聚合酶、DNA DL2 000 Marker等購自寶生物工程(大連)有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (100) 膠回收試劑盒購自美國Omega公司；普通質量微量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 毒株

病毒液為實驗室早先將某規?；B豬場疑似感染PRV的豬腦組織、淋巴結及臟器混合樣本經處理后接種Vero細胞，經病毒鑒定所獲得的PRV GZJS2017毒株。

1.3 PCR引物設計

參照文獻[11]的引物序列并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PRV gE基因的PCR擴增

用核酸提取試劑盒提取將接種Vero細胞的3代病毒液的核酸作為模板，進行PRVgE基因的PCR擴增，PCR反應體系總體積為25.0 μL：核酸模板4.25 μL，dNTP 4.0 μL，2×GC Buffer Ⅱ12.5 μL，LA Taq酶0.25 μL，上、下游引物各2.0 μL。PCR反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性45 sec；63℃退火45 sec；72℃延伸2 min；35個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 gE基因的克隆與序列分析

將目的基因經凝膠回收純化后克隆至pMD19-T載體，重組陽性質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。利用生物學分析軟件DNAStar、MEGA6.0軟件對測序所得序列并分別與GenBank上登錄的其他PRV毒株的gE基因序列(表1)進行比對、分析。

表1 本研究中所收集的國內外PRV毒株的gE基因Tab.1 The gE genes of domestic and foreign PRV strains

2 結果與分析

2.1 PRV GZ-JS2017株gE基因的PCR擴增及其TA克隆

提取病毒液核酸進行PCR擴增，經電泳凝膠檢測見有1700 bp左右的目的條帶，結果與預期相符(圖1)。

M：DNA DL 2 000Marker 1：PRVgE基因PCR擴增

圖1 PRVgE基因的PCR產物電泳檢測結果
Fig.1 PCR product ofgEgene of PRV

將PCR產物純化回收后TA克隆至pMD19-T載體，經過氨芐抗性和雙酶切等鑒定后的陽性重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果與NCBI上的相關RRVgE基因進行比對，結果相似度均在95%以上，表明構建成功且所獲得序列為PRVgE基因序列。其序列如下：

5'-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGC AGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACC GAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGG GCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGA GGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGAC GATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACC GCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTG AGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTC CGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCG ACGGCGCCGTGCCGGCCGGGATCTGGACGTTCCTG CCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGACCAC GGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACCTGG TGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCCGGAG ATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGTGCC GCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCG GAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGC CACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACG ACGCCTCGGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGG TGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGT GGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCG CTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGAC ACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATG GGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGA CTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGC TGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGC GCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGC GTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGG TGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTG CTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGA CGCCTTCGGCGAGGAGGTGCACACGAACGCCACCG CGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGACC CACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCT CGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCA AGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCAC CCCGTGGGGCCCCGGCGGCGGCGACGACGCGATC TACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGC GCACCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCG GGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTG ATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCATCTGGCTCTG CGTGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGG CCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACA TGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCAC GAGGACTACTACGACGGCGACGACGACGACGACG AGGAGGCGGGCGTCATCCGCCGGCGGCCCGCCTC CCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAGGGGCCGTAC GCGAGCCTGGACCCCGAGGACGAGTTCAGCAGCG ACGAGGACGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGA GGCGCCCCGCTCCGGCTTCGACGTCTGGTTCCGCG ATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAA CTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGATGTCCC GCCCCGCTTAA-3'

將所獲得的核苷酸序列所編碼的氨基酸進行推導，結果如下：

MRPFLLRAAQLLALLALALSTEAPSLSAETTPG PVTEVPSPSAEVWDDLSTEADDDDLNGDLDGDDRR AGFGSALASLREAPPAHLVNVSEGANFTLDARGDGA VPAGIWTFLPVRGCDAVSVTTVCFETACHPDLVLGR ACVPEAPEMGIGDYLPPEVPRLRREPPIVTPERWSP HLSVLRATPNDTGLYTLHDASGPRAVFFVAVGDRPP APADPVGPARHEPRFHALGFHSQLFSPGDTFDLMP RVVSDMGDSRENFTATLDWYYARAPPRCLLYYVYE PCIYHPRAPECLRPVDPACSFTSPARARLVARRAYA SCSPLLGDRWLTACPFDAFGEEVHTNATADESGLY VLVMTHNGHVATWDYTLVATAAEYVTVIKELTAPA RAPGTPWGPGGGDDAIYVDGVTTPAPPAHPWNPY GRTTPGRLFVLALGSFVMTCVVGGAIWLCVLCSRRR AASRPFRVPTRARTHMLSPVYTSLPTHEDYYDGDD DDDEEAGVIRRRPASPSGDSGYEGPYASLDPEDE FSSDEDDGLYVRPEEAPRSGFDVWFRDPEKPEV TNGPNYGVTANRLLMSRPA.

2.2 PRV GZ-JS2017株gE基因的遺傳特征分析

測序結果表明，GZ-JS2017株gE基因完整編碼區長1740 bp，可編碼579個氨基酸殘基，其中A+T = 26.03%，C+G = 73.97%。根據gE基因的核苷酸序列分析結果顯示：所收集的株序列中，變異區主要集中于140 bp～142 bp，國內毒株均在其間插入ACG，1489 bp～1491 bp國內毒株大部分插入了GAC；與所有毒株比對GZ-JS2017株在1250 bp出現了G→A(圖2)。由此推導，本次所分離毒株GZ-JS2017株經gE基因序列分析發現在gE的aa 48和gE的aa 496均有1個天冬氨酸的插入。

圖2 PRV gE變異點比對Fig.2 Mutation loci alignment of gE gene of PRV

gE基因的核苷酸分析結果顯示PRV不同地域毒株之間同源率達98.8%～99.9%，而推導氨基酸序列同源率達98.3%～99.7%。其中，核苷酸同源性和氨基酸相似性均最高的是GZJS2017株與BJ-tiger-2012株、GDHS2株gE基因，核苷酸同源性為99.9%，氨基酸相似性為99.7%。結果見圖3、圖4。

圖3 PRV gEI基因的核苷酸同源性比對Fig.3 Nucleotide homology alignment of gE gene of PRV

圖4 PRV gE基因所推導的氨基酸序列相似性比對Fig.4 Amino acid sequence alignment deduced from gE gene of PRV

將GZ-JS2017株與表1中所收集的序列應用生物學信息軟件進行系統發育進化樹構建(圖5)?；趃E基因氨基酸序列的遺傳進化分析得知：GZJS2017株與GDHS2株、HN-DZ株處于同一較小分支上，形成單獨的1個小亞群，推測這3株PRV具有較近血緣關系；與GZ-JS2017株遺傳關系較遠的是SXJC2011株，且SXJC2011株單獨處于一個支系。

圖5 PRV gE基因系統發育進化樹Fig.5 phylogenetic tree of gE gene of PRV

3 討論與結論

在研究過程中，有研究人員將PRV變異毒株與經典毒株相比較發現，在gE蛋白的第48位和第492位中各存在一個天冬氨酸(Asp)的插入，尤其是在第492位的一個天冬氨酸的插入可視作鑒定PRV變異株的分子特征[14]。在本研究中，作者選取GenBank中來源不同的毒株進行對比，發現在這兩個位點的天冬氨酸插入與PRV毒株的分離年代和分離地區均無顯著的變化規律。此外，疫苗株(Bartha-K61)可對經典株(PRV S株)提供完整的免疫保護，但對變異株(PRV-HeNI )則無法完全保護，這揭示了PRV經典株和變異株之間存在著抗原性差異[15]。文中所研究的基因是從貴州省金沙縣某規?；B豬場疑似感染PRV的豬腦組織、淋巴結及臟器混合樣本所分離出的毒株。經gE基因序列分析發現在gE48位和gE496位均有1個天冬氨酸的插入，符合變異毒株基本特征。通過分析，GZ-JS2017株的gE基因與不同地域毒株之間的同源性達98.8%～99.9%，而推導氨基酸序列同源性達98.3%～99.7%。其中，核苷酸同源性和氨基酸相似性均最高的是BJ-tiger-2012株、GDHS2株gE基因，核苷酸同源性為99.9%，氨基酸相似性為99.7%。結果可為貴州地區的PRV的分子流行病學提供一定參考。

綜上，從文中gE基因結果可推測該毒株為變異毒株。在后續研究中，課題組將從gE基因遺傳變異規律和作用機理方面進行研究，為進一步預防、控制和根除豬偽狂犬病的發生和流行提供一定的參考依據。

參 考 文 獻：

[1] 殷 震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997：998-1856.

[2] B·E·斯特勞，S·D·阿萊爾，W·L·蒙加林，等.豬病學[M].8版.北京：中國農業大學出版社，2000：195-196.

[3] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].6版.北京：中國農業出版社，1979：221-223.

[4] Fuchs W， Backovic M， Klupp B G，etal.Structure-based mutational analysis of the highly conserved domain IV of glycoprotein H of pseudorabies virus[J].JournalofVirology， 2012， 86(15)：8002.

[5] Wills E， Mou F， Baines J D.The UL31 and UL34 Gene Products of Herpes Simplex Virus 1 Are Required for Optimal Localization of Viral Glycoproteins D and M to the Inner Nuclear Membranes of Infected Cells[J].JournalofVirology， 2009， 83(10)：4800-4809.

[6] 余秋穎，常洪濤，陳文定.2012-2013年新流行豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及其gE、TK、gD基因序列分析[J].中國獸醫學報，2014，34(10)：1573-1583.

[7] Prieto J，Martin Hennandez A M，Tabares E.Loss of pseudorabies virus thymidine kinase activity due to a single base mutation and amino acid substitution[J].JGenVirol，1991，72(5)：35-39.

[8] 陳華良，王和興，李小鵬，等.廣東地區豬偽狂犬病流行病學調查與gE、TK基因遺傳進化分析[J].廣東畜牧獸醫科技，2016，41(2)：5-9.

[9] 馬興杰.鑒別豬偽狂犬病病毒gE、gB、gG的納米PCR及熒光定量PCR方法的建立及評價[D].哈爾濱：哈爾濱獸醫研究所.

[10] 楊漢春.豬偽狂犬病的流行現狀與特點[J].豬業科學， 2016， 33(1)：38-38.

[11] 行 宇.河南部分地區豬偽狂犬病流行病學調查[D].鄭州：河南農業大學，2014.

[12] 劉吉山，李 峰，姚春陽，等.豬偽狂犬病的流行特點與防控誤區[J].北方牧業，2015(15)：18-19.

[13] 李 寧，吳志明，閆若潛，等.2012-2014年河南省豬偽狂犬病病毒gE基因和TK基因的遺傳變異分析[J].中國獸醫學報，2016，36(10)：1653-1657.

[14] 趙鴻遠， 彭金美， 安同慶，等.豬偽狂犬病病毒變異株的分離鑒定及其gE基因的分子特征[J].中國預防獸醫學報，2014，36(07)：506-509.

[15] AN T Q， PENG J M， TIAN Z J，etal.Pseudorabies virus variabp in Bartha-K61-vaccinated pigs， China， 2012[J].EmergingInfectiousDiseases， 2013， 19(11)：1749.