勻漿法提取沙棗果總黃酮工藝研究

張圓圓 孟永斌 徐 蕾 賈 楠 孟慶煥 項鳳影 路 祺

(東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

沙棗又稱七里香、香柳等(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(Elaeagnus)落葉喬木或小喬木。在國內集中分布于西北部的各個省區以及內蒙古的西部地區，大致分布在北緯34°以北。天然的沙棗林密集分布在瑪納斯河、甘肅疏勒河、新疆塔里木河、內蒙古的額濟納河兩岸。沙棗渾身是寶，花可提芳香油或調香原料，樹液能提沙棗膠，木材細致堅韌，可以做家具、農具，沙棗根蘗性比較強，能夠保持水土，抵抗風沙，改善土壤，調節氣侯等，用于防護林、用材林和風景林等。沙棗果肉含有多糖、黃酮、蛋白質和維生素等營養成分，可生食或熟食，有些地區甚至將果肉打粉，然后摻在面粉內代替主食，還可以用來釀酒和醋，或做果醬、糕點等食材[1]。沙棗黃酮可用于治療燒傷、腸炎腹瀉、脾胃虛弱、支氣管炎等，沙棗在新疆作為維吾爾藥(稱“吉嘎旦”)在民間已經有悠久歷史[2]。

黃酮類化合物，也稱類黃酮[3]，是以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類黃色色素。在植物體內，有兩種存在形式，大多數與糖結合成苷類或碳糖基的結合態存在。由于其分子結構中含未共用的孤對電子，又表現出堿性，所以可以和無機酸生成鹽，但是不穩定，遇水之后迅速分解[4]。黃酮類化合物的主要生理活性有[5～8]：(1)心血管系統活性；(2)抗菌及抗病毒活性；(3)抗腫瘤活性；(4)抗氧化自由基活性；(5)抗炎、鎮痛活性；(6)保肝活性；(7)其他功能，除上述功能外，黃酮類物質還對平滑肌的解痙，支氣管的松弛、機體免疫力提高等有一定作用。

勻漿提取是指組織通過加入萃取溶劑進行組織勻漿或磨漿，以提取組織中有效成分的一種提取方法。此方法不但縮短了提取時間，而且提取效率高、操作步驟簡便。近年來廣泛應用于中草藥有效成分的提取和食品加工等領域，效果良好[9]，如勻漿法提取虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇[10]、勻漿法提取石斛中多糖[11]、勻漿提取刺五加主要酚苷及苷元[12]、勻漿提取銀杏葉原花青素工藝等[13]。本研采用勻漿法提取沙棗果總黃酮，通過單因素實驗和正交實驗優化沙棗果總黃酮提取工藝條件，通過本研究將為沙棗果的開發利用提供理論依據，也為沙棗果保健品的開發提供數據支持。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

沙棗果由阿拉善盟悅禾科技生態有限責任公司提供；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁均為分析純，購于科密歐化學試劑廠；蘆丁(標準品)購于Sigma公司。

1.2 實驗儀器

HL-60型烘箱，購于上海躍進醫療器械有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀，DK-98-I型水浴鍋，購于泰特化工設備有限公司；勻漿萃取裝置，購于飛利浦公司；3K-30型離心機，購于Sigma公司；美國Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型紅外光譜儀；BS124S電子天平，購于北京賽多利斯有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品準備和總黃酮的提取

沙棗果凍干后，進行果肉與種子分離，得沙棗果肉。

勻漿法基礎實驗條件為：取沙棗果10 g，按比例加入一定濃度的乙醇溶液，室溫下勻漿提取，反應結束后立即3 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液檢測黃酮得率。在其它實驗條件固定情況下，分別探討乙醇濃度、料液比、反應時間、反應次數，4個因素對勻漿法沙棗果總黃酮得率的影響，并通過正交實驗優化沙棗果總黃酮提取工藝條件。

2.2 總黃酮檢測方法

總黃酮檢測方法如下：取0.5 mL稀釋一定倍數后樣品置于比色管中，依次分別加入0.5 mL 5%(w/v)亞硝酸鈉，0.5 mL 10%(w/v)硝酸鋁，4.0 mL 4%氫氧化鈉和4.5 mL 95%乙醇，混勻以后，避光靜止15 min，510 nm波長下檢定吸光值。以蘆丁為標準品制作標準曲線，5 mg蘆丁標準品加5 mL甲醇溶解。配置濃度1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1的標準溶液，空白樣品是以蒸餾水代替樣品。通過標準曲線計算黃酮濃度，從而計算黃酮得率，公式如下：

(1)

式中：y代表總黃酮得率(%)；c表示樣品濃度(mg·mL-1)；v表示測定時提取液總體積(mL)；m表示樣品質量(mg)[14～19]。

2.3 紅外光譜分析

將2.0 mg試樣與200 mg溴化鉀(KBr)混勻，經瑪瑙研缽研磨后壓片，采用美國Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型紅外光譜儀(掃描范圍4 000～400 cm-1)進行紅外光譜測定[20]。

2.4 掃描電鏡分析

利用掃描電鏡進行微觀形貌觀察，所采用的儀器為MX2600FE型環境掃描電子顯微鏡。用導電膠將烘干、粉碎過80目篩的樣品固定在樣品平臺上，噴金，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面形態。

3 結果與分析

3.1 單因素實驗部分

3.1.1 乙醇濃度對沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實驗條件為：在料液比1∶20 g·mL-1、勻漿提取時間3 min、室溫不變的條件下，分別選取40%、55%、70%、85%、100%，5個乙醇濃度，探討乙醇濃度對勻漿法提取沙棗果總黃酮的影響；傳統水浴法實驗條件為：在料液比1∶20 g·mL-1、提取溫度70℃、提取時間30 min不變的條件下，探討乙醇濃度對傳統水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

當乙醇濃度低于55%時，隨著乙醇濃度的逐漸增加沙棗果總黃酮得率也隨之逐漸增加；當乙醇濃度等于55%時，沙棗果總黃酮得率最高；當乙醇濃度高于55%時，隨著乙醇濃度的增加沙棗果總黃酮得率逐漸降低(圖1)。這是因為在一定的范圍內，隨著乙醇濃度的增加，沙棗果總黃酮類化合物的溶解度逐漸升高；當乙醇濃度超一定范圍時，導致細胞內的蛋白凝固，黃酮則不易溶出，所以選擇55%乙醇作為勻漿法提取沙棗果總黃酮最佳濃度。

圖1 乙醇濃度對沙棗果總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on Elaeagnus angustifolia fruit flavonoids extraction

在圖1中也可以看出，傳統的水浴提取方法在乙醇濃度相同的情況下，總黃酮的得率均遠遠低于其勻漿法。因此在乙醇濃度相同的情況下，勻漿法更適合提取總黃酮。

3.1.2 料液比對沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實驗條件為：在55%乙醇濃度、勻漿提取時間3 min、室溫不變條件下，探討料液比對勻漿提取沙棗果總黃酮的影響，分別選取以下幾個料液比，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1；傳統水浴法實驗條件為：在70%乙醇濃度、提取溫度70℃、提取時間30 min不變的條件下，探討料液比對傳統水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

由圖2可知，當料液比小于1∶30 g·mL-1時，隨著料液比的逐漸增加沙棗果總黃酮得率也跟著逐漸增加；當料液比等于1∶30 g·mL-1時，沙棗果總黃酮得率最高；當料液比大于1∶30 g·mL-1時，隨著料液比的增加沙棗果總黃酮得率逐漸趨于穩定。這是因為在一定的范圍內，隨著料液比的不斷增加，反應溶劑所占比例逐漸增加，使得沙棗果粉與提取溶劑的接觸率大大增加，導致沙棗果總黃酮類化合物的溶解量逐漸增加；而當料液比超出一定范圍時，沙棗果中黃酮類化合物提取較為充分，而繼續增加料液比，沙棗果總黃酮類化合物的得率趨于穩定。所以選擇1∶30 g·mL-1作為勻漿提取沙棗果總黃酮最佳料液比。

圖2 料液比對沙棗果總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

雖然在傳統的水浴提取方法，總黃酮的得率隨著料液比的增大而增加，但是其增加幅度遠低于同樣條件下勻漿法提取的總黃酮得率。因此在料液比相同的情況下選擇勻漿法提取總黃酮更為經濟實用。

3.1.3 勻漿提取時間對沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實驗條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、提取溫度室溫、55%乙醇不變的情況下，分別選取以下幾個提取時間1、3、5、7、9 min，來探討提取時間對沙棗果總黃酮得率的影響；傳統水浴法實驗條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇濃度、提取溫度70℃不變的條件下，探討提取時間對傳統水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

圖3 勻漿提取時間對沙棗果總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of time on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

由圖3可知，隨著勻漿時間的延長，沙棗果總黃酮得率逐漸增加；當勻漿時間等于5 min時，沙棗果總黃酮得率最高；當勻漿時間大于5 min時，隨著勻漿提取的進一步延長，沙棗果總黃酮得率基本趨于穩定。這是因為充足的勻漿時間有利于沙棗果總黃酮的溶解與溶出，隨著勻漿提取時間進一步延長，沙棗果總黃酮得率逐漸增加，但過長的勻漿時間，提取物中雜質物質不斷溶出，阻礙黃酮類化合物溶出，導致黃酮得率也不會明顯增加。因此，勻漿法提取沙棗果總黃酮的適宜提取時間為5 min。

傳統的水浴提取方法黃酮得率先隨著水浴時間的延長而增加，后趨于平穩，其得率最高為4.43%?？梢悦黠@看出勻漿法提取總黃酮時，不僅表現在時間上大大縮短，而且得率也遠高于傳統水浴提取方法。

3.1.4 勻漿提取次數對沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實驗條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、提取溫度室溫、乙醇濃度55%、提取時間為5 min不變的情況下，來探討提取次數對沙棗果總黃酮提取的影響，分別選取以下幾個提取次數，即1、2、3、4、5、6次；傳統水浴法實驗條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇濃度、提取溫度70℃、提取時間30 min不變的條件下，探討提取次數對傳統水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

由圖4可知，隨著提取次數的不斷增加，沙棗果總黃酮得率不斷降低，當提取次數超過3次時，沙棗果總黃酮總得率隨著提取次數繼續增加，基本保持恒定。勻漿法第一次提取沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮的63.48%，第二次提取沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮15.89%，前兩次提取的沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮的80%左右，即勻漿法提取二次后，沙棗果總黃酮已經基本提取充分，考慮到后期溶劑回收成本等問題，確定勻漿法提取沙棗果總黃酮的適宜提取次數為2次。

圖4 提取次數對沙棗果總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

傳統的水浴提取方法與勻漿法相比，勻漿法得率高于水浴法，勻漿法提取總黃酮更完全一些。優于傳統水浴法，即不需要太多的提取次數便可達到高的提取率。

綜上所述，勻漿法提取沙棗果總黃酮不僅減少了乙醇的用量，縮短了提取時間，降低料液比，減少了提取次數，而且提取總黃酮得率也遠高于傳統水浴提取法。因此，勻漿法是更適合于沙棗果總黃酮的提取方法。

3.2 正交實驗部分

通過前面單因素實驗確定采用勻漿法提取沙棗果總黃酮，以沙棗果總黃酮得率為勻漿法提取沙棗果總黃酮能評價指標，對乙醇濃度、勻漿時間和料液比進行L9(3)4正交實驗設計，探討并優化勻漿法提取工藝條件(表1～2)。

表1 L9(3)4正交實驗因素和水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal array design L9(3)4

通過直觀分析，根據R值，可知最優實驗條件為：A2B3C2，即乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時間5 min。從各因素極差值可知，A>B>C，對勻漿法沙棗果總黃酮得率影響的主次順序為：乙醇濃度>勻漿時間>勻漿料液比。

表2 L9(3)4正交實驗結果Table 2 Orthogonal array design L9(3)4 and experimental results

勻漿法提取沙棗果總黃酮的方差分析數據見表3。

查表有F0.01(2,2)=99.00；F0.05(2,2)=19.00；F0.1(2,2)=9.00。

當F>F0.01，有高度顯著影響；當F0.01>F>F0.05，有顯著影響；當F0.05>F>F0.1時，有一定的影響；當F

計算結果表明，因素A的FA，為F0.05>FA>F0.1；因素B的FB，為FB

表3 勻漿法沙棗果總黃酮得率方差分析Table 3 The variance analysis of E.angustifolia fruit flavonoid yield with homogenization

通過正交實驗得到勻漿法提取沙棗果總黃酮的優化工藝條件：乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時間5 min，提取次數2次，重復性驗證實驗結果表明得率穩定，重復性較好，沙棗果總黃酮總得率為6.57%。綜上所述，勻漿法相較于水浴法，操作更加簡便、快捷，作用效果更強，得率更高，所以沙棗果的提取選擇勻漿法更佳，本研究對勻漿法提取的沙棗果總黃酮提取物及剩余物進行進一步結構表征。

3.3 紅外光譜分析

圖5 沙棗果勻漿提取物紅外光譜圖Fig.5 FTIR of the extraction of E.angustifolia fruit with homogenate method

3.4 掃描電鏡分析

圖6分別是沙棗果原料、沙棗果勻漿提取剩余物的SEM圖片?？梢悦黠@看出沙棗果渣(A)表面相對光滑沒有明顯裂痕，表面有淀粉粒存在。經過勻漿處理的沙棗果渣提取剩余物(B)表面有小裂痕和組織縫隙，并且表面的淀粉粒也大量消失，這說明勻漿處理對沙棗果的組織結構影響較大，其原因是勻漿將樣品進行機械粉碎，導致沙棗果的組織結構被破壞，大大增加了乙醇與提取物的接觸面積[21～23]。

圖6 沙棗果原原料(A)、沙棗果勻漿提取剩余物(B)的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of E.angustifolia fruit pomace(A) and the extraction residues of E.angustifolia fruit with homogenate method(B)

4 結論

通過傳統水浴提取法和勻漿提取法單因素對比實驗，可以明顯看出勻漿法提取沙棗果總黃酮具有乙醇用量少，提取時間短，提取次數少等優點，總黃酮得率也遠高于傳統水浴提取法。通過L9(3)4正交實驗設計，優化勻漿法提取工藝條件，其最優工藝為：乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時間5 min，室溫，勻漿提取次數2次，勻漿提取沙棗果黃酮類化合物的最大得率為6.57%。從實驗結果可以看出勻漿法提取沙棗果黃酮得率高，操作更加簡便、快捷。本研究對勻漿法提取的沙棗果黃酮提取物及剩余物進行結構表征。通過對提取物進行紅外表征可以看出，勻漿法提取的沙棗果提取物中含有黃酮類化合物的特征峰；通過對剩余物進行SEM結構表征可以看出，勻漿法對樣品的機械作用強烈。