藍豬耳花粉管在雌蕊生長途徑中鈣的分布特征

陳素紅， 鄒 璞， 廖景平

(1. 廣東食品藥品職業學院， 廣州 510520； 2. 中國科學院 華南植物園， 廣州 510650)

花粉離體萌發和花粉管生長實驗早已證實了鈣在其中起重要作用。然而，花粉管的離體生長系統可以模擬但不能完全代替花粉管的體內生長狀況。要證實體內花粉管生長與鈣的關系，還需要對花粉管在體內雌蕊組織中的生長途徑加以研究。

目前，國內多位研究者[1-6]采用焦銻酸鹽沉淀法研究了多種植物的花粉管生長軌道(柱頭表面、花柱引導組織、子房壁內表面、珠孔)，發現雌蕊組織均有豐富的鈣沉淀顆粒，且在這些組織中的鈣沉淀顆粒多分布在引導組織細胞壁和胞外基質的質外體系統中，證明在離體實驗中花粉管生長需要鈣的特征在體內可以從富含鈣的引導組織中得以滿足。離體實驗中還發現花粉管有向高鈣濃度方向生長的向化性特征，并在金魚草[7]的雌蕊中也確實發現鈣有明顯的梯度分布，推測雌蕊中的鈣梯度分布是吸引花粉管定向生長的原因。但除了少數幾種植物如煙草[5]、金魚草[7]、萵苣[8]和獼猴桃[9]的雌蕊中存在鈣梯度分布，在向日葵[1]、陸地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等其他許多植物的雌蕊中并沒有發現明顯的鈣梯度。這可能與植物種類、研究方法等有關，需進行更為廣泛的觀察。

鈣在體內生長的花粉管中的分布特征也是研究受精前花粉管生長與鈣關系的重要方面。Jaffe等用示蹤元素45Ca作為外源鈣發現，進入花粉管中的45Ca最初集中在花粉管頂端區域[11]。Reiss等用proton-induce x-ray emission (PIXE) 技術測量麝香百合花粉管中的總鈣分布，結果顯示花粉管頂端區域的鈣濃度高，而基部的相對較低，呈現梯度分布[12]。多位研究者[13-16]用金霉素處理后觀察花粉管中的細胞器膜鈣時發現花粉管頂端區域含較高的膜鈣，而基部區域的膜鈣較低，也呈現出梯度分布。隨著研究技術的改進，有關花粉管中游離鈣的梯度分布研究顯示，鈣梯度的明顯區域在花粉管頂端20 μm以內，20 μm以后的鈣梯度變化幅度較小[17-21]。然而，對花柱中生長的花粉管的鈣分布研究非常少，只在向日葵[1]、陸地棉[2]和煙草[22]中，研究者應用焦銻酸鹽沉淀法觀察到體內生長的花粉管尖端的細胞器區段的胞質、細胞器及管尖外周鈣含量較高，并且也僅在煙草研究中根據授粉和未授粉的花柱在開花后1 d引導組織胞外基質在靠近子房的部位有密集的鈣沉淀顆粒，推測花柱中存在鈣離子濃度梯度。本文采用焦銻酸鉀沉淀法對藍豬耳體內生長的花粉管以及柱頭和花柱中的鈣分布進行定位，以期揭示鈣對藍豬耳體內花粉管生長的作用機制。

1 材料和方法

試驗材料藍豬耳(Toreniafournieri)種植在中科院華南植物園溫室，每年4—12月開花，盛花期6—10月。藍豬耳花柱長1.5 cm，通?；ǚ墼谥^上萌發需要1 h，花粉管在體內生長7 h到達子房頂部。將花柱0.3、0.9和1.5 cm處人為分為3個時期(從柱頭端開始量取)，授粉后1 h取柱頭，2、4及6 h取上述3個時期的花柱，7 h取子房頂部。每次取柱頭、3個時期的花柱以及子房頂部進行相對應比較(圖1)。取去雄未授粉的柱頭、0.3、0.9、1.3和1.5 cm 處(從柱頭端開始量取)的花柱進行對比觀察。切取柱頭和約1 mm 長的花柱，子房頂部，將其迅速放入含2%戊二醛、1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的前固定液(pH 7.8)中，4℃下固定12～24 h。用1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的洗滌液(pH 7.8)洗滌3次，每次30 min，之后轉入1%鋨酸、1%焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配制的后固定液(pH 7.8)中，在 4℃下固定16 h。再用上述洗滌液沖洗，經乙醇梯度(30%、50%、70%、80%、90%和100%)脫水，環氧丙烷置換，Epon 812環氧樹脂滲透并包埋。每個處理切5個樣品。用LK-S型超薄切片機切片80 nm厚的柱頭和花柱切片用醋酸雙氧鈾染色20 min，清洗并晾干后用日本JEM-1010透射電子顯微鏡100 kV觀察、拍照。

圖1 藍豬耳雌蕊以及劃分花柱時期

2 結果與分析

藍豬耳柱頭屬濕型，由兩裂片構成。裂片相對的內表面為花粉接受面，外表面為非接受面。在接受面上的柱頭細胞為乳突細胞，緊接乳突細胞之下是引導組織。藍豬耳花柱屬開放型，花柱道兩端較寬、中間較窄，其中充滿分泌物?；ㄖǖ烙幸粚犹鼗膬缺砥ぜ毎?，即通道細胞(或稱引導組織細胞)。

2.1 花粉萌發以及花粉管在花柱內生長過程中鈣的分布特征

藍豬耳在開花當天，柱頭兩裂片緊閉，開花后2 d，兩裂片敞開，開始自然接受花粉。開花前去雄，開花后2 d進行人工授粉。授粉1 h，花粉在柱頭上水合并萌發。剛萌發出的花粉管壁上沉淀較多的鈣沉淀顆粒，花粉管內容物中很少有鈣沉淀顆粒分布(圖版Ⅰ-1)。此時花粉萌發的外環境中鈣分布較少。授粉2 h，花粉管沿著引導組織細胞生長至0.3 cm花柱處。此時與花粉管相鄰的通道細胞細胞壁上及胞外基質中分布較多的鈣沉淀顆粒，而花粉管尖端細胞器區段的鈣沉淀顆粒不多，集中分布在花粉管壁上，且鈣沉淀顆粒較大(圖版Ⅰ-3)；而管中內容物的鈣沉淀顆粒很少，僅在管內細胞器上有少量鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-6)。授粉4 h，花粉管生長至0.9 cm花柱處。此時花粉管中的鈣沉淀顆粒有所增加，并且在花粉管生長的胞外基質中也均勻分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-4)?；ǚ酃苤写罅康拟}沉淀顆粒聚集在管壁上，并且幾乎連成線狀；在管內的液泡中也有較大的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ-7)。授粉6 h，花粉管生長至1.5 cm花柱(花柱基部)處。此時花粉管中分布大量的鈣沉淀顆粒，而其周圍的胞外基質中鈣分布相對少一些(圖版Ⅰ-5)。大量的鈣沉淀顆粒不僅分布在花粉管壁上，而且在管內細胞器以及其他內容物中也有大量鈣分布(圖版Ⅰ-8)。授粉7 h，花粉管已從花柱生長至子房頂部子房室中。此時花粉管頂端的鈣主要分布在管壁上，管內幾乎沒有鈣分布；然而在花粉管生長的外環境子房室中有大量的鈣沉淀顆粒，并且大量的細小鈣沉淀顆粒包圍著花粉管頂端(圖版Ⅰ-2)。藍豬耳花粉管在花柱中生長期間的鈣含量隨著生長存在著逐漸遞增的過程，花粉管到達花柱基部時，鈣沉淀顆粒達到最多。待花粉管進入子房室，室內環境中鈣含量遠大于花粉管中的(圖版Ⅰ-2)。藍豬耳花粉萌發及花粉管在花柱內生長過程中的鈣分布情況見表1。

圖版I 花粉萌發及花粉管在花柱內生長過程中鈣的分布特征

Plate I Calcium distribution ofToreniafournieripollen tubes during pollen germination and pollen tube growth in style

1：授粉1 h，花粉剛萌發出花粉管，Bar=500 nm；2：授粉7 h，花粉管進入子房頂部，Bar=1 μm；3：授粉2 h的花粉管，Bar=2 μm；4：授粉4 h的花粉管，Bar=2 μm；5：授粉6 h的花粉管，Bar=2 μm；6：授粉2 h的花粉管，Bar=500 nm；7：授粉4 h的花粉管，Bar=500 nm；8：授粉6 h的花粉管，Bar=500 nm

2.2 花粉管在各發育階段的不同細胞學區域中鈣的分布特征

花粉管是頂端生長，通過細胞壁物質成分向頂端的分泌增加花粉管的長度?；ǚ酃艿慕Y構可依次區分出不同的細胞學的區域：頂端區、亞頂端區、核區、液泡化區和胼胝質塞區。藍豬耳的花粉管在各個發育階段的不同區域中的鈣分布存在差異。生長2 h的花粉管中，亞頂端區域前段的花粉管壁上鈣沉淀顆粒不多，但鈣沉淀顆粒細小(圖版Ⅱ-9)，而在管內細胞器上有較多的鈣沉淀顆粒，且鈣沉淀顆粒較大(圖版Ⅱ-10)；亞頂端區域中段的花粉管壁上鈣沉淀顆粒較多，且鈣沉淀顆粒較大，同時在管內物質中也分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-11)；亞頂端區域末段的花粉管中出現小液泡，此段花粉管壁以及內容物中有少量的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-12)。生長4 h的花粉管中，亞頂端區的花粉管壁上有大量的鈣沉淀顆粒，幾乎連成粗線狀，而花粉管內細胞器以及內容物中鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅱ-13)；核區的花粉管壁以及細胞器上聚集較多的大顆粒的鈣沉淀(圖版Ⅱ-14)，而管內細胞核及其中央的內容物中鈣沉淀顆粒相當少，幾乎沒有(圖版Ⅱ-15)；液泡化區的花粉管中鈣沉淀顆粒很少，只在電子密度大的內容物中有分布，花粉管壁以及液泡中幾乎沒有鈣分布(圖版Ⅱ-16)。生長7 h的花粉管中，頂端區的花粉管壁上聚集大量的細小鈣沉淀顆粒，而管內鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅱ-17)；亞頂端區的花粉管中鈣沉淀顆粒很少，而在管外基質中分布較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-18)；核區的花粉管中幾乎沒有鈣沉淀顆粒，僅在管壁上有少量的鈣沉淀顆粒，但在管外基質中分布著較多的細小鈣沉淀顆粒(圖版Ⅱ-19)。藍豬耳同一發育階段的花粉管中鈣呈現出梯度分布；隨著花粉管的不斷生長，頂端區域的鈣不斷增加，鈣梯度分布更明顯。

表1 藍豬耳花粉管在花柱內生長過程中的鈣分布變化

“-” 表示沒有鈣沉淀顆粒； “+” 表示有少量鈣沉淀顆粒； “++”表示有一些鈣沉淀顆粒； “+++”表示有較多鈣沉淀顆粒；“++++”表示有大量鈣沉淀顆粒

2.3 未授粉柱頭以及花柱的鈣分布特征

為探索柱頭和花柱組織中的鈣分布特征與花粉萌發和花粉管生長之間的關系，對只去雄未授粉的柱頭和花柱組織進行觀察。取藍豬耳開花后2 d(花去雄3 d)的柱頭和花柱進行觀察。柱頭接受面的乳突細胞已形成了大液泡，在細胞壁，細胞質以及液泡膜上鈣沉淀顆粒相當少(圖版Ⅲ-20)。未授粉花柱0.3 cm處的通道細胞形狀規則，其細胞壁和大液泡中幾乎沒有鈣沉淀顆粒，而在胞外基質中有一些細小的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-21)。在花柱0.9 cm處，通道細胞形狀不規則，細胞壁和大液泡中鈣沉淀顆粒仍然很少，而在花柱道內分泌物中有較多的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-22)。在花柱1.3 cm處，通道細胞變得更加不規則，并且胞外基質以及花柱道中的分泌物很多，在胞外基質和分泌物中有大量的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-23)。在花柱1.5 cm處，通道細胞變得規則，且在細胞中有淀粉粒出現，此時胞外基質中均勻分布著大量的鈣沉淀顆粒，而通道細胞中仍然很少鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-24)；然而在此處花柱組織的微管束細胞中也很少有鈣沉淀顆粒，只是在胞內液泡膜上有零星的鈣沉淀顆粒(圖版Ⅲ-25)。藍豬耳未授粉花柱由上至下鈣沉淀顆粒呈遞增的梯度分布。藍豬耳未授粉柱頭及花柱的鈣分布情況見表2。

圖版II花粉管在各發育階段的不同細胞學區域中鈣的分布特征Plate II Distribution of calcium in different cytological regions of Torenia fournieri pollen tubes at different development stages

9～12：生長2 h的花粉管；9為亞頂端區域前段，Bar=500 nm；10為亞頂端區域前段花粉管內細胞器，Bar=500 nm； 11為亞頂端區域中段，Bar=200 nm；12為亞頂端區域末段，Bar=200 nm。13～16：生長4 h的花粉管；13為亞頂端區，Bar=500 nm；14為核區，Bar=200 nm；15為核區中兩精細胞核(SN)及營養核(VN)，Bar=200 nm；16為液泡化區，Bar=200 nm。17～19：生長7 h的花粉管；17為頂端區，Bar=1 μm；18為亞頂端區，Bar=1 μm；19為核區，Bar=1 μm

3 討論與結論

鈣不僅影響藍豬耳花粉萌發，也對花粉管生長起著非常重要的調節作用[23]。藍豬耳花粉在柱頭上萌發時，柱頭細胞的鈣沉淀顆粒很少，花粉管壁上鈣沉淀顆粒較多；花粉管剛進入花柱時，相鄰的花柱通道細胞和胞間基質中鈣沉淀顆粒較多，而管壁上的鈣沉淀顆粒相對減少，管內的鈣沉淀顆粒相對增多；花粉管伸長至花柱基部時，相鄰花柱組織的鈣沉淀顆粒相應減少，而管壁上的鈣沉淀顆粒先增多后減少，管內的鈣沉淀顆粒逐漸增多；當花粉管進入子房，子房室內有大量的鈣沉淀顆粒，花粉管壁上鈣沉淀顆粒又有增多，而這時管內的鈣沉淀顆粒相對較少。由此推測：花粉萌發時，藍豬耳的花粉中有足夠的鈣滿足花粉萌發；花粉管生長中，鈣不斷從花柱組織細胞中進入花粉管，滿足花粉管內雄性生殖細胞的分裂和花粉管的生長；花粉管進入到子房，花粉管內無需太多的鈣，而管外高鈣環境有助于花粉管進入珠孔。

圖版III 未授粉柱頭以及花柱鈣的分布特征Plate III Calcium distribution of stigma and style in unfertilized Torenia fournieri

20：柱頭的乳突細胞，Bar=10 μm。21：0.3 cm花柱處的引導組織(TT)和花柱道(SC)，Bar=10 μm。22：0.9 cm花柱處的引導組織和花柱道，Bar=10 μm。23：1.3 cm花柱處的引導組織和花柱道，Bar=2 μm。24：1.5 cm花柱處的引導組織和花柱道，Bar=2 μm。25：1.5 cm花柱處的微管束(VB)，Bar=10 μm

表2 藍豬耳未授粉柱頭及花柱的鈣分布變化

“+” 表示有少量鈣沉淀顆粒； “++”表示有一些鈣沉淀顆粒； “+++”表示有較多鈣沉淀顆粒；“++++”表示有大量鈣沉淀顆粒

已經有多位研究者對花粉管中的總鈣、膜鈣和游離鈣分布進行研究，發現花粉管中的鈣呈梯度分布，并且發現花粉管中的鈣梯度分布現象僅在生長中的花粉管內存在[12-21]。在培養基中加入或直接向花粉管內注射鈣抑制劑后，花粉管中的鈣梯度消失，花粉管停止生長；去掉鈣抑制劑后，花粉管中的鈣梯度重新建立，花粉管恢復生長[24-30]?；ǚ酃苤械拟}梯度分布與花粉管的生長密切相關。藍豬耳體內生長的花粉管中鈣也呈梯度分布，并且隨著花粉管不斷生長，鈣的梯度分布更加明顯。

對雌蕊花粉管生長軌道的鈣分布研究結果表明，凡是在花粉管生長所必經的部位中均有較相鄰組織更為豐富的鈣，而且這些組織的鈣主要分布在質外體系統——細胞壁和胞外基質[8]。然而，雌蕊花粉管軌道中鈣的梯度分布與花粉管定向生長的關系仍無定論。到目前為止，也只在煙草[5]、金魚草[7]、萵苣[8]和獼猴桃[9]中發現花粉管軌道的鈣呈梯度分布，而在向日葵[1]、陸地棉[2]、水稻[3]、刺槐[10]等植物不同切段的花柱中，并未觀察到鈣的梯度分布。不同植物花柱中鈣梯度分布現象存在差異。這種差異的產生可能有以下幾個原因：一是有些植物花柱中的鈣分布差異很小，現有的技術難以檢測出這種鈣分布梯度；二是不同植物花柱中是否存在鈣梯度分布特征可能與植物的種類有關。短花柱的植物花粉管可能無需花柱鈣梯度分布定向吸引即可到達胚囊，而一些長花柱的植物花粉管到達胚囊需要很長時間，可能需要有某種機制保證花粉管的定向生長。本實驗中，藍豬耳的花柱屬中等長度，在未授粉時已出現花柱中有明顯的鈣梯度分布特征，并且在授粉后，花粉管生長到達的部位均有較為豐富的鈣。從而推測藍豬耳花柱的鈣梯度分布對其中生長的花粉管可能也具有引導作用。