重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的質量分析及發展方向

楊勁松，吳濤，李金祥

（1中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2中國農業科學院，北京 100081）

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI），是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，可導致家禽、各種野鳥、特別是遷徙水禽的感染，是世界動物衛生組織（OIE）規定的必須報告的動物疫病[1]，我國將其列為一類動物疫病。1878年首次報道禽流感病毒（AIV）在意大利雞群中暴發[2]，隨后世界各地均有該病暴發和流行的報道，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。l997年發生在我國香港的禽流感感染人事件，更加引起人們對該病的關注。2005年，H5N1亞型禽流感病毒引起野生鳥類的大規模死亡，并隨野生鳥類的遷徙而傳播到更廣泛的區域[3]。十余年來，我國發現的H5亞型禽流感病毒多為H5N1亞型。但是近些年來，在我國H5N2、H5N8、H5N6、H5N5 等亞型顯著增多[4-6]。

高致病性禽流感在我國暴發后，農業農村部采取免疫與撲殺相結合的防控措施,其中全面免疫是關鍵技術措施和突出特點[7]，因此在較短時間內就控制了禽流感疫情[8]。國家規定每年春秋兩季進行集中強制免疫，使用的疫苗主要為重組禽流感病毒滅活疫苗。對于疫苗質量，國家高度重視，并對疫苗生產企業采取了嚴格的監管措施和市場準入制度，為禽流感的防控發揮了重要作用[9]。為了促進疫苗生產企業的技術進步，保障疫苗質量，對近年來重組禽流感滅活疫苗的質量情況進行了分析，并提出了禽流感疫苗的研制發展方向，以期為禽流感疫苗的生產和研制提供有益的幫助。

1 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的種類和使用情況

2004年初我國首次批準使用了低致病性 H5N2亞型的禽流感病毒滅活疫苗（N28株），但由于H5N2亞型禽流感病毒的復制效率低，與國內流行株抗原匹配性差。2005年1月，又推出了針對第0分支的Re-1株疫苗。隨著病毒抗原性的不斷變異[10-11]，原有疫苗的保護效率下降，不足以對新出現的病毒或變異株提供足夠的保護[12]。2007年至2008年3月，先后推出針對第7分支的 Re-4株疫苗和第2.3.4分支病毒的Re-5株疫苗[13]。2010年開始，第2.3.4分支的病毒開始出現較大變異[14-16]，導致Re-5株疫苗對其保護效果較差。2012年3月，我國推出了針對第2.3.2.1分支Re-6株疫苗[17]，替換原來的 Re-5株疫苗。2014 年4月，推出針對第7.2分支[18]的Re-7株疫苗，替換原來的 Re-4株疫苗，2016年至今我國未再分離到7.2分支病毒。2013年以來，多地暴發了由2.3.4新分支病毒引起的高致病性禽流感疫情，國際H5N1進化工作組將該變異株分支命名為第2.3.4.4分支[19]。2015年 11月，農業部批準了針對該分支病毒的 Re-8株疫苗，并于2016 年2月開始上市使用。目前，對于禽流感H5亞型病毒來說，2.3.4.4分支是在我國流行的主要分支，另有少量的新型 2.3.2.1分支病毒和野鳥型病毒。到目前為止，高致病性禽流感H5N1毒株共劃分出 10 個進化支（0—9）[20]。禽流感 Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8 各疫苗株之間的血凝抑制抗原相關系數在 0.17—0.67 之間，表明不同分支之間的抗原性有較大差異[21]，因此必須使用匹配相應分支的疫苗才能取得理想的防控效果。

2 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的生產現狀

目前國內生產重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗的生產企業共有10家，分別是哈爾濱維科生物技術開發公司、青島易邦生物工程有限公司、肇慶大華農生物藥品有限公司、乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠、遼寧益康生物股份有限公司、廣東永順生物制藥股份有限公司、哈藥集團生物疫苗有限公司、南京梅里亞動物保健有限公司、吉林冠界生物技術有限公司、山東信得動物疫苗有限公司。其中吉林冠界生物技術有限公司和山東信得動物疫苗有限公司采用懸浮細胞工藝生產，其余8個廠家均采用雞胚工藝進行疫苗生產。

國內近三年來取得生產批準文號并已投入生產的重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗主要有：重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗（Re-6株）、重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株）、重組禽流感病毒 H5亞型二價滅活疫苗（Re-6株+Re-8株）、重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5亞型）二價滅活疫苗（細胞源，Re-6株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5亞型）三價滅活疫苗（細胞源，Re-6株+Re-7株+Re-8株）、重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）。根據禽流感病毒的流行趨勢，2016年 4月至 2017年7月農業部規定將重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）作為主要的高致病性禽流感強制免疫疫苗[22]；2017年7月至今，農業部規定將重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）作為主要的高致病性禽流感強制免疫疫苗[23]。

近三年重組禽流感病毒滅活疫苗的批簽發批數和總產量均呈明顯上升趨勢，2017年的總產量較 2015年增長了26.2%（表1）。

表1 2015—2017年重組禽流感病毒滅活疫苗產量統計Table 1 Production statistics of recombinant avian influenza virus inactivated vaccine from 2015 to 2017

3 我國對重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的質量監管

重組禽流感病毒滅活疫苗的質量監管由農業部獸醫局主管，中國獸醫藥品監察所負責具體實施。為進一步加強疫苗質量監管，把對農業部定點生產企業進行獸藥 GMP監督檢查、實施產品的監督抽檢和落實批簽發制度作為三大有效的監管手段。此外，針對投訴、舉報等情況，還要組織不定期的獸藥 GMP飛行檢查。

3.1 企業監督檢查

中國獸醫藥品監察所每年組織春秋兩季監督檢查，實現對重組禽流感病毒滅活疫苗生產企業每年兩次全覆蓋檢查。檢查重點包括企業生產情況、GMP有效管理情況、疫苗生產和檢驗過程中的質量控制情況、生物安全管理情況等。2015年檢查18家次，2016年檢查18家次，2017年檢查20家次。

3.2 產品監督抽檢

不僅從企業成品庫抽檢，而且從產品流通、使用環節著手，加強對政府招標采購重大動物疫病疫苗的監管，并且逐年增加流通、使用環節的抽檢數量。近三年共監督抽檢重組禽流感H5亞型滅活疫苗130批次，合格率均為100%。

3.3 成品批簽發制度

每批獸用生物制品在出廠前須經監管部門審查批準后，產品方可上市銷售。中國獸醫藥品監察所調整了批簽發環節工作方式，提高產品批簽發執行標準，將獸藥國家標準改為企業成品的內控質量標準，對提高產品質量取得了較好效果。2015年重組禽流感病毒滅活疫苗批簽發批數為1 507批，2016年為1 715批，2017年為1 856批，簽發率均為100%。由此看出重組禽流感病毒滅活疫苗的批簽發批數呈明顯上升趨勢，2017年的批簽發批數較 2015年增長了23.2%。

4 我國重組禽流感病毒H5亞型滅活疫苗的質量分析

作為合格疫苗的評價標準，一定要做到安全、有效和質量可控。筆者根據企業上報的批簽發報告情況，以2016年至2017年農業部規定的高致病性禽流感強制免疫疫苗重組禽流感病毒 H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）為例，進行數據分析。隨機選取了4家疫苗生產企業，分別為3家雞胚生產工藝（簡稱為企業1、企業2、企業3）和1家懸浮細胞生產工藝（簡稱為企業 4），從疫苗的安全性和效力兩方面對重組禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗進行質量分析，為疫苗生產企業提供改進生產工藝、提升疫苗質量的建議。

4.1 疫苗的安全性分析

對4家企業在2016至2017年生產的488批次疫苗安全檢驗統計結果顯示，所有批次均符合規定。這與現地反饋重組禽流感病毒滅活疫苗在免疫后一般無可見不良反應的說法相一致，但在局部地區偶有發生蛋雞免疫后產蛋率下降的現象。經分析，造成此現象有兩個方面原因。一是免疫過程對蛋雞的應激會造成短時間的產蛋率下降，但此影響過程是短暫的。有報道指出，處于產蛋期的蛋雞對應激因素敏感，對外界任何刺激都會表現出一定的應激反應，在接種后產蛋率一般都會出現 2—3周的下降[24]。因此，為了減少這種情況的發生，在產蛋高峰期接種的雞群，可以在接種免疫前后各3 d，在飲水后飼料中添加電解多維、維生素C等抗應激劑，緩解和降低各種應激反應。同時，將疫苗恢復至室溫，在傍晚注射也可降低應激反應。從疫苗本身講，不排除疫苗中雜蛋白含量較高或甲醛、內毒素含量較高而引起的疫苗免疫副反應，可通過抗原純化和降低內毒素含量等措施來減少疫苗副反應的發生。

4.2 疫苗的效力分析

對4家企業的488批次重組禽流感病毒H5亞型三價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株+Re-8株）的效力檢驗數據情況進行分析，其中2016年生產327批，2017年生產161批。檢測方法均為血清學方法。

4.2.1 Re-6株、Re-7株、Re-8株不同組分效價的比較 435批雞胚生產工藝疫苗Re-6株組分抗體效價的幾何平均滴度（GMT）為8.7 log2；Re-7株組分抗體效價 GMT為 7.4 log2；Re-8株組分抗體效價GMT為8.7 log2。53批懸浮培養工藝疫苗Re-6株組分抗體效價GMT為8.3 log2；Re-7株組分抗體效價GMT為8.1 log2；Re-8株組分抗體效價GMT為8.2 log2。由此可以看出，所有批次疫苗抗體效價GMT至少高于國家標準（6 log2）1個滴度以上，而Re-6株和Re-8株組分抗體效價GMT至少高于國家標準2個滴度以上。對于雞胚生產工藝疫苗而言，Re-6株和Re-8株組分抗體效價GMT基本一致，均高于Re-7株組分1個滴度以上，在生產工藝規程要求抗原配比為 1∶2∶1的情況下，說明 Re-6株和 Re-8株病毒的雞胚適應性明顯優于 Re-7株。而懸浮培養工藝疫苗的3個組分，抗原按生產工藝規程要求配比為1∶2∶1的情況下，抗體效價的幾何平均滴度基本一致，說明 Re-7株的細胞適應性優于雞胚適應性。雞胚生產工藝疫苗3個組分中有2個組分抗體效價GMT高于懸浮培養工藝疫苗近0.5個滴度，加之生產工藝技術環節較懸浮培養工藝操作簡單，因此是市場占有量遠高于懸浮培養工藝疫苗的主要原因。

4.2.2 不同生產年份疫苗效價的比較 4家企業2016年共生產三價疫苗 327批，2017年共生產 161批。從不同組分抗體效價 GMT（圖 1）可以看出，4個企業2017年生產疫苗的各組分抗體效價GMT均比2016年有所提高，說明生產工藝的不斷成熟和優化，企業對產品質量的進一步嚴格把關。

4.2.3 不同生產企業間疫苗效價的比較 從 4家企業2016至2017年生產疫苗的不同組分抗體效價GMT（圖 2）可以看出，產品的效價雖然都超過了國家標準，但質量水平還是參差不齊的，水平較高企業產品3個組分抗體效價的幾何平均滴度比較低者要高出1.5個滴度以上。

4.2.4 同一疫苗生產企業不同批次疫苗批間差異的情況 從4家企業2016至2017年生產疫苗的3個組分抗體效價GMT的最高值和最低值（圖3）可以看出各生產企業批間差異還是比較大，這雖有生產工藝不斷成熟和優化的因素，但相近批次批間差異也會出現較大差異，說明了企業生產工藝并不十分穩定。究其原因，作為雞胚工藝疫苗的重要生產原料低免胚（或非免胚）的質量批間差異較大；細胞工藝疫苗細胞的培養水平不穩定，呈現出同一批次產品 3個組分滴度水平較一致，但整體出現高低起伏的特點，可以用“一損俱損，一榮俱榮”來形容。

圖1 不同生產年份不同組分疫苗抗體效價的比較Fig. 1 Antibody titer comparison of different components in different production year

5 我國禽流感病毒滅活疫苗生產工藝的改進及發展方向

5.1 生產工藝改進方向 好疫苗的評價標準，一定要安全性高、免疫效果好、副反應很小或無副反應?，F有禽流感病毒 H5亞型滅活疫苗的安全性高，對同分支的禽流感流行毒株免疫效果好。滅活疫苗中含有的甲醛和細菌內毒素是造成疫苗副反應的直接原因，因此改進生產工藝，降低疫苗中甲醛和細菌內毒素的含量，可以降低疫苗的副反應。

圖2 不同生產企業間疫苗效價的比較Fig. 2 Comparison of vaccine antibody titer from different manufacturers

圖3 同一疫苗生產企業不同批次疫苗抗體效價批間差異的情況Fig. 3 Difference of antibody titer between different batch vaccines in the same manufacturer

5.1.1 離心純化工藝 通過連續離心后過濾的方式去除收獲尿囊液中的雜質（如蛋殼、卵黃液等）、雜蛋白以及降低污染細菌的數量。這樣既可有效的降低滅活時甲醛的使用量，又可以降低細菌內毒素的含量。

5.1.2 濃縮純化工藝 通過超濾濃縮設備及配套膜包進行抗原液的濃縮和甲醛的洗脫，可有效提高抗原含量和降低抗原液中的甲醛含量。

5.1.3 滅活劑的選擇 甲醛是最傳統的、應用最廣泛的滅活劑，但也存在刺激性強、致癌危險、降低免疫原性、滅活效果受多種因素影響等缺陷。β-丙內酯（BPL）對病毒具有很強的滅活作用[25]，而且能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，接種反應也輕微。但與甲醛相比，BPL對細菌的滅活效果不理想且價格昂貴。鹽酸聚六亞甲基胍（PHMG），具有使用濃度低、作用速度快，性質穩定，易溶于水的特點，常溫下使用具有廣譜高效、長期抑菌作用、毒性低和使用安全等優點，但 PHMG價格較貴，不易推廣應用。二乙烯亞胺（BEI），具有不損傷病毒的抗原性和免疫原性的優點[26]，但對細菌的殺滅作用較弱且有誘導產生突變型病毒株可能。BEI現已成功地用于疫苗的生產，特別是由于其保存、毒性及成本等方面的優勢而被廣泛采用[27]。有研究表明，BEI在滅活流感病毒感染性的同時，能較好地保持病毒的抗原性[28]，并可減少疫苗的毒副作用，是開發研制禽流感病毒滅活疫苗的新型滅活劑。

5.2 禽流感疫苗的發展方向

就目前所研制的禽流感疫苗來看，雞胚生產工藝的全病毒滅活疫苗占據主流市場。主要原因是雞胚生產工藝繁殖病毒的含量高，對同分支的禽流感流行毒免疫效果良好，生產工藝技術相對簡單，免疫持續時間較長等特點。但雞胚作為疫苗的生產基質，存在受雞胚來源、質量及自身不穩定性的影響，造成疫苗批間質量差異顯著以及大規模生產時暴露性接種和收獲增加了生物安全風險。而且由于雞胚的大小不一，限制了自動化接種、收獲，生產效率無法大幅度提高；雞胚中雜蛋白還可能引起過敏反應。另外，大批量雞胚的廢棄雞胚的處理也給企業及環境帶來了沉重負擔。

采用懸浮細胞工藝可進行大規模生產，縮短了生產周期，具有自動化控制程度高、批間差異相對較小和產品均一性程度高等優點。但目前免疫效果并不優于雞胚工藝疫苗，而且由于疫苗中或多或少含有細胞碎片的原因，有可能帶來一些副反應，這也是其沒有能夠占據主流市場的原因。如何進一步提高禽流感病毒在懸浮細胞的繁殖滴度，優化和提升生產工藝，是懸浮細胞工藝研究的發展方向。

目前研究的疫苗還有重組活載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、通用疫苗等。其中，重組活載體疫苗克服了滅活苗所存在的一些問題，可同時誘導體液免疫和細胞免疫[29]，但有母源抗體的家禽接種后效果并不理想且接種后不易通過監測抗體水平確認免疫效果。亞單位疫苗制作成本過高，免疫期短，不適于用作生產用疫苗，只能作為一種實驗室研究手段。核酸疫苗是當前禽流感疫苗研究的前沿技術，其抗原合成和提呈過程與病原的自然感染相似，可同時誘導體液免疫和細胞免疫，具有其他疫苗所不具備的優點，是現階段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗，也是禽流感疫苗研究的一大熱點。

在防控禽流感的過程中，最大的難題來自抗原漂移。由于頻繁的抗原漂移，使得常規疫苗常常需要不斷更新毒株才能維持保護力，這給實際生產帶來很多不便。具有交叉保護性的廣譜免疫原性的通用疫苗可以有效的解決這一難題[30]，是現階段流感疫苗研究的一個重要研究方向。