HBV PC區和BCP區變異與Peg-IFNα-2b療效的關系及治療前后的變化*

汪 波， 劉艷艷， 李家斌,2△

(1安徽醫科大學第一附屬醫院感染科， 安徽 合肥 230022； 2安徽醫科大學附屬巢湖醫院感染科， 安徽 巢湖 238000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是引起肝硬化、肝衰竭以及肝細胞肝癌的主要病因[1],當前主要治療藥物包括核苷酸類似物(nucleotide analogues,NAs)和聚二乙醇化干擾素α(peginterferon α,Peg-IFNα)兩大類。Peg-IFNα較NAs除了具有抗病毒作用外還具有免疫調節的功能，有限療程(48周)Peg-IFNα治療可以使25%～30%的患者獲得持久的治療應答[2]；但是Peg-IFNα在臨床應用過程中存在治療費用高、副作用大以及應答率相對較低等問題，因此選擇合適的患者接受Peg-IFNα治療仍是有待解決的重要臨床問題。乙肝e抗原(HBeAg)水平是評估疾病狀態及抗病毒療效的一項重要血清學指標，HBeAg血清轉換多預示疾病的緩解[3]，但是HBeAg血清轉換的機制仍不完全清楚。由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)逆轉錄酶缺乏保真性，病毒在長期感染復制過程中容易發生突變；其中前核心(precore, PC)區G1896A和基本核心啟動子(basal core promoter, BCP)區A1762T/G1764A突變可以終止或降低HBeAg合成，因此與HBeAg血清轉換存在一定關系[4]。

近年來有研究提出，CHB患者治療前HBV存在PC區G1896A和/或BCP區A1762T/G1764A位點變異均可能會降低Peg-IFNα療效，從而不推薦將Peg-IFNα作為此類患者首選治療方案[5-6]；但是此類研究對象以西方A/D基因型CHB患者占主體，無法代表國內B/C基因型為主的CHB患者治療情況。國內相關研究則局限于病例數少、治療使用普通干擾素以及療程不足48周[7-8],因而PC/BCP區相關突變對國內B/C基因型為主的CHB患者48周足療程Peg-IFNα-2b治療應答的影響尚不明確。此外患者體內HBV PC/BCP區突變情況在治療前后的變化鮮有報道，是否與干擾素療效存在關系仍不清楚。因此，本研究的目的是通過分析HBeAg陽性CHB患者中PC/BCP區突變情況，探討其與Peg-IFNα-2b病毒學和血清學應答的關系，以及PC/BCP區突變在Peg-IFNα-2b治療前后的變化情況，為臨床工作者的診療選擇提供依據。

材 料 和 方 法

1 研究對象

所有HBeAg陽性CHB患者均來自于先前的一項安徽省隨機開放多中心Ⅳ期臨床研究[9-10](2012年6月～2014年7月),共有100名患者參與初始臨床試驗，排除11位血清標本不全患者，共89例患者血清進行測序分析；去除20例測序失敗(重復2次)患者，最終69例患者納入當前研究。每位患者診斷及治療指征符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015版)》[11]：(1)HBsAg和HBeAg兩項均陽性并且超過6個月;(2)HBV DNA≥20 000 IU/mL且丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)≥2×正常值上限(upper limit of normal value,ULN)，≤10×ULN;(3)血清總膽紅素<2×ULN。排除標準：(1)合并HAV、HCV、HDV、HEV或HIV等其它病毒感染;(2)有精神病史及未控制的癲癇、失代償肝硬化等;(3)任何其它嚴重基礎疾病的。所有患者均簽署知情同意書，研究得到安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準(Grant No: K2010003)。

2 研究方法

2.1治療方法及隨訪 入選本研究的69例患者均接受Peg-IFNα-2b(商品名佩樂能，愛爾蘭先靈葆雅公司)1.5 μg/kg，每周1次，皮下注射；其中35例(51%)患者隨機聯合阿德福韋酯(10 mg/d，口服)；療程共48周并隨訪24周。每位患者于第0、4、8、12、24、36、48、60和72周定期隨訪并采集外周靜脈血20 mL，離心取上清，-80 ℃保存備用。

2.2臨床實驗室檢查 患者HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平由患者隨訪時于安徽醫科大學第一附屬醫院感染科實驗室檢測完成。Roche COBAS TaqMan 48熒光定量PCR儀檢測HBV DNA載量，檢查下限為20 IU/mL，檢測上限為1.70×108IU/mL。HBsAg、HBeAg和HBeAb檢測使用美國羅氏公司產品：HBsAg檢查下限為0.05 IU/mL；HBeAg<1 COI為陰性，>1 COI為陽性；HBeAb<1 COI為陽性，>1 COI為陰性。HBV基因型在患者治療前由上海之江生物有限公司檢測完成。

2.3HBV病毒基因組提取、擴增及測序 取患者第0周和第72周于-80 ℃保存的血清各200 μL，按照QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen)說明，提取基因組DNA，-80 ℃保存備用。根據中國HBV參考序列[12]，使用Oligo 7.0軟件設計一對引物：上游引物F1為5’-GCAATGTCAACGACCGACCT-3’，下游引物R1為5’-CACCCCAACACAGAATAGCTTG-3’，擴增片段(第1 677～2 069位核苷酸)包含PC區和BCP區。擴增條件為:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s、57.3 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環。PCR產物直接送華大基因測序，測序結果使用Chromas 2.1和Lasergene 7.1軟件分析。

2.4分組及治療應答 分組參考Sonneveld等[5]的研究，分為野生型(wild-type,WT;無G1896A和A1762T/G1764A突變)和突變型(存在G1896A和/或A1762T/G1764A突變)，其中突變型包括PC突變型(只存在G1896A突變，或同時存在G1896A突變和野生株)、BCP突變型(只存在A1762T/G1764A突變，或同時存在A1762T/G1764A突變和野生株)和PC+BCP突變型(同時存在G1896A、A1762T/G1764A突變，有或無野生株)。根據患者HBeAg基線水平四分位數可分為4組：第1組(基線HBeAg<1.958 0 logIU/mL)，第2組(>1.958 0，<2.891 9 logIU/mL)，第3組(>2.891 9，<3.028 9 logIU/mL)和第4組(>3.028 9 logIU/mL)。HBeAg血清轉換定義為：HBeAg<1 COI(陰性)，HBeAb<1 COI(陽性)。聯合應答(combined response，CR)：72周隨訪結束時HBeAg血清轉換+HBV DNA<2 000 IU/mL。

3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數資料采用2檢驗或Fisher確切概率法。R×C列聯表資料的2檢驗若P<0.05，則進行任意兩組間比較(卡方分割)并行顯著性校正。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 患者特征

由于患者接受Peg-IFNα-2b單藥(n=34，49%)與聯合阿德福韋酯(n=35，51%)對其72周治療應答無影響(HBeAg血清轉換率兩組比較2=0.189，P=0.664；聯合應答率兩組比較2=0.289，P=0.591)，再結合文獻[5-6, 13]的分組方式，2組患者將被合并分析基線特征及治療學應答，見表1。

2 患者PC/BCP區基線突變情況

BCP區A1762T/G1764A野生型和突變型PCR產物測序結果見圖1A、1B；PC區G1896A野生型和突變型PCR產物測序結果見圖2C、2D。69例患者中14例檢測為WT(20.29%)，55例檢測為突變型(79.71%)，其中PC突變型19例(27.53%)，BCP突變型20例(28.99%)，PC+BCP突變型16例(23.19%)，見表1。根據HBV基因型再分類，B基因型患者中PC突變型占18例(51%)，而C基因型患者中僅1例(3%)；C基因型患者中BCP突變型占19例(58%)，而B基因型患者中僅1例(3%)。B/C基因型患者在WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構成比上存在差異(2=34.553，P<0.001)，見圖2。

表1患者基線特征

Table 1. Baseline characteristics of the study cohort (Mean±SD.n=69)

IndexDataDemographics Age (year)26.7±5.6 Sex (male/female)47/22 (68.1%/31.9%)Peg-IFNα-2b monotherapy34 (49.3%)Laboratory results ALT (U/L)231.26±131.29 HBV DNA (logIU/mL)7.48±1.24 HBsAg (logIU/mL)4.04±0.61 HBeAg (COI)645.30±454.60HBV genotype B35 (50.7%) C33 (47.8%) Others1 (1.4%)Sequencing results WT14 (20.29%) PC mutant19 (27.53%) BCP mutant20 (28.99%) PC+BCP mutant16 (23.19%)

HBeAg: hepatitis B e antigen; HBsAg: hepatitis B surface antigen.

3 WT和突變型患者基線血清標志物的比較

與突變型相比，WT患者HBeAg基線水平更高(t=2.312，P=0.024)，ALT水平較低(t=2.312，P=0.012)，而年齡、HBV DNA和HBsAg的差異則均無統計學顯著性，見表2。

4 72周時患者PC/BCP區突變情況

72周時共59例(86%)患者標本擴增產物測序成功。治療后14例WT患者中10例(71%)轉變為突變型；治療后PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型患者也均存在突變情況的改變，但均未發現向WT逆轉的現象；患者基線和72周WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構成比發生明顯變化(2=13.178，P=0.004)，見圖3。

5 WT和突變型患者HBeAg基線水平及治療應答比較

根據所有患者的HBeAg水平四分位數，由低到高將患者分為4組,隨著HBeAg滴度的增高，WT患者在各組所占百分比表現出逐漸升高的趨勢，見圖4A;第1組在72周有著相對更高的HBeAg轉陰率和聯合應答率(53%和41%)，4組在72周時的HBeAg轉陰率和聯合應答率的差異均無統計學顯著性(Fisher確切概率法,P=0.070和P=0.054,P值均接近臨界值)，見圖4B。

Figure 1. The sequencing results for BCP region A1762T/G1764A (A and B) and PC region G1896A sites (C and D).

圖1BCP區A1762T/G1764A和PC區G1896A位點測序結果

Figure 2. Frequencies of PC and BCP mutants at baseline in the study cohort with HBV genotypes B and C.

圖2B、C基因型患者WT和各突變型所占百分比

6 PC區和BCP區突變對治療72周患者應答效果的影響

所有患者根據突變情況分為WT組和突變型組，72周時HBeAg血清轉換率和聯合應答率的差異無統計學顯著性(Fisher確切概率法，P=0.523和P=1.000)，見圖5A。當患者根據突變情況分為WT組、BCP突變型組、PC突變型組和PC+BCP突變型組時，72周時HBeAg血清轉換率和聯合應答率的差異仍無統計學顯著性(Fisher確切概率法，P=0.207和P=0.590)，見圖5B。

討 論

乙肝病毒感染是世界性公共衛生難題，全球約有2.4億慢性乙型肝炎患者，中國大約有9 300萬[14]。積極的抗病毒治療是阻止慢性乙型肝炎疾病進展的重要手段，Peg-IFNα在其中發揮了重要作用[1]。

表2 WT和突變型患者基線水平血清標志物的比較

*P<0.05vsWT group.

Figure 3 Baseline and week 72 sequencing results in patients (n=59).

圖3患者基線和72周WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型變化情況

Figure 4. The proportion of WT and mutant divided by baseline HbeAg level (A) and relationship between baseline HbeAg level and response to Peg-IFNα-2b at week 72 (B). Combined response was defined as HBeAg serconversation and HBV DNA<2 000 IU/mL at week 72.

圖4HBeAg基線水平與突變的關系及對應答的影響

HBeAg血清學轉換是HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療過程中一項重要的血清學應答指標，而影響HBeAg血清轉換包括宿主、病毒及治療方案等多種因素[15-16]。有研究發現HBeAg血清轉換與HBV病毒PC區G1896A和BCP區A1762T/G1764A變異終止或降低HBeAg合成存在一定關系[4]。在本研究中我們發現治療前WT組較突變型組HBeAg水平明顯偏高，這與之前的研究是相符合的[13, 17]。但是對于PC和BCP區相關變異對Peg-IFNα治療應答的影響依然存在爭議。Sonneveld等[5]的一項回顧性研究提示PC和/或BCP區突變型HBeAg陽性CHB患者很難獲得對Peg-IFNα的治療應答，從而提出治療前WT患者可以作為Peg-IFNα的最適治療對象，而突變型患者則不建議接受Peg-IFNα治療。而我們的研究發現，不管是72周HBeAg血清轉換率還是聯合應答率，WT和突變型患者均未表現出顯著差異。這可能是因為我們的研究對象以國內B/C基因型患者為主，而Sonneveld等[5]的研究對象以歐洲A/D基因型患者為主；且A基因型CHB患者PC/BCP突變的發生率本身較低。因此人種和基因型的差異可能造成了CHB患者對Peg-IFNα不同治療應答的結局，而PC/BCP區相關變異與Peg-IFNα應答可能并不存在相關性。

Figure 5. Relationship between WT and mutant groups and response at week 72 in total cohort (A) and response between each group (B). Combined response was defined as HBeAg serconversation and HBV DNA<2 000 IU/mL at week 72.

圖5PC區和BCP區突變與72周患者應答效果的關系

當我們根據患者治療時HBeAg基線滴度由低到高分為4組分析時，我們發現72周4組HBeAg血清轉換率和聯合應答率的差異均不存在統計學顯著性，但HBeAg低滴度組似乎有著更高的聯合應答率，這仍然有待擴大樣本量進一步驗證。有趣的是我們發現，突變型患者較WT有著更高的ALT基線水平。這可能是因為PC/BCP區突變可能導致Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)高表達[18]，而TLR2為炎癥介導因子，此時高ALT水平可能預示著患者體內肝細胞炎癥應答活躍，干擾素可能也更易發揮作用。這可能與本研究中突變型患者應答略好于WT存在一定關系。這樣的發現仍需要進一步驗證。

我們對72周測序成功的患者突變情況分析發現，患者基線和72周時WT、PC突變型、BCP突變型和PC+BCP突變型所占構成比發生明顯變化，存在向BCP突變型和PC+BCP突變型集中的趨勢，而突變型在72周時未發生向WT逆轉。這可能提示了HBV準種在Peg-IFNα介導的機體免疫壓力下的自然選擇過程。Nie等[19]研究發現在自發HBeAg血清轉換過程中PC/BCP變異是累計增高的，這與Peg-IFNα介導的突變位點改變是相似的。HBV準種的動態變化為今后的抗病毒治療也提供了新的思路。

本研究依然存在一些缺陷，普通測序技術對樣本中低于20%以下的突變株較難檢測[20]，這可能對實驗結果產生影響。這有待更靈敏的實驗技術來驗證我們的觀點。

綜上所述，通過本研究我們發現HBV病PC區G1896A和BCP區A1762T/G1764A變異與B/C基因型為主的HBeAg陽性CHB患者Peg-IFNα-2b治療應答并無明顯關系。若國內根據PC/BCP變異與否判斷患者Peg-IFNα療效可能會產生偏差；對于患者治療前后HBV病毒PC/BCP變異構成比發生改變這一現象，尚需進一步的覆蓋宿主、病毒和治療方案的多方面分層研究，從而對CHB抗病毒治療做出更加詳細可靠的分析，以達到個體化治療的目的。