分離純化胰島細胞超薄切片的瓊脂預包埋制備方法

首都醫科大學（100069）金良韻 姬曼 孫竹林

利用電子顯微鏡對樣品進行觀察和研究，不僅要有先進精密的儀器，更要有制備樣品所需的各種技術技巧[1]。由于胰島細胞體積小，分布分散，給電鏡取材造成了困難；而在人類胰島細胞數量龐大，僅占胰腺總體積的1%～2%，如常規電鏡取材則費時費力。本研究采用了膠原酶Ⅺ灌注法對小鼠進行取材，避免了取不到胰島細胞的尷尬。同時采用瓊脂預包埋的方法，該方法對樣品進行多次離心沉淀不會損傷樣品超微結構。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康C57/6J雄性小鼠

1.2 主要儀器設備與試劑 ①超薄切片機（leica UC7）,透射電鏡(HITACHI HT7700)。②戊二醛、鋨酸、乙醇、丙酮、Epon812、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，均購自美國EMS（Electron microscopy science）公司。瓊脂糖為美國Sigma公司產品。膠原酶Ⅺ(#C7657)為美國Sigma-Aldrich公司產品。

1.3 方法

1.3.1 分離、純化胰島細胞團 將小鼠麻醉，打開腹腔充分暴露十二指腸及周邊胰腺，探查膽總管，用動脈夾夾閉靠近十二指腸的乳頭處，經膽總管注射2.5mL膠原酶Ⅺ溶液，可見膠原酶沿胰尾順序充盈，再將其胰尾及其他部分完整摘取，放入50mL離心管中，38℃水浴箱消化10min，加入遇冷HBSS緩沖液至40mL停止消化，1400rpm離心1min，棄掉上清液，重復離心3次。加入4℃ Histopaque1077 7mL重懸，再沿離心管管壁緩慢加入4℃DMEM培養基7mL，可見離心管內液體分液，2000rpm，離心10min。并緩慢吸出兩液間的胰島移至含有6mLHBSS的細胞培養皿（60mm）中。在體式顯微鏡下，用移液槍挑取完整胰島，將挑取出來的胰島放入另一個含有6mLHBSS的細胞培養皿（60mm）中，手動挑取重懸胰島3次。

1.3.2 戊二醛預固定 在培養皿中加入預冷的4℃戊二醛3～5mL，固定10min，再將液體移至離心管中，離心1500rmp，10min，棄掉上清，重復加入預冷的戊二醛，放入4℃冰箱固定2h。后去掉上清液，加入0.1MPB緩沖液洗3次，每次10min。待后續包埋。

1.3.3 瓊脂預包埋 用0.1MPB緩沖液配制瓊脂，將其配成2%瓊脂溶液，用酒精燈加熱至瓊脂完全溶解，待瓊脂溶液溫度降到43℃，仍然保持溶液狀態。將胰島細胞離心（1500rpm，5min），吸出離心管中的PB緩沖液，僅留少量緩沖液浸過胰島細胞，待瓊脂溶液溫度降至43℃，向胰島細胞離心管中快速加入適量液態的2%瓊脂溶液，再加入適量PB，迅速離心（1500rpm，3～5min），胰島細胞呈團狀同瓊脂塊一同沉于離心管底，放入4℃冰箱中凝固。

1.3.4 鋨酸后固定 用1%鋨酸對其進行后固定，時間以不超過2h為宜。固定后樣品組織呈黑色，將帶有胰島細胞的塊狀瓊脂取出，并向其修整為1mm3的小塊，再放入試管中繼續后續步驟。雙蒸水對細胞清洗3次，每次10min。

1.3.5 脫水、置換、滲透及包埋 分別對其進行50%、70%、90%、100%酒精脫水，每次10min；環氧丙烷置換2次，每次15min；Epon812樹脂低純度（1∶1）滲透40min室溫，中純度（1∶3）滲透40min室溫，純樹脂滲透40min室溫。包埋聚合35℃5h，60℃5h，70℃9h。

1.3.6 超薄切片 將聚合完成的樹脂塊在leica UC7徠卡切片機上切成70nm厚度的超薄切片。撈至100目的銅網，待紅外線烘干后，醋酸雙氧鈾染色20min，檸檬酸鉛染色2min，蒸餾水沖洗后于透射電鏡(HITACHI HT7700)下觀察。

2 結果

超薄電鏡下（透射電鏡HT7700）觀察胰島細胞，核為圓形，核膜清晰完整，核周間隙正常，胞質內可見結構清晰的線粒體、核糖體、粗面內質網等細胞器，另可見較多的內分泌顆粒，多數為胰島B細胞的分泌顆粒，內部為胰島素，少數為其他類型的內分泌顆粒，均獲得結構清晰完整的胰島細胞。

附圖1、附圖2 小鼠胰腺細胞?？梢娂毎そ缦耷逦?、細胞核完整、胞漿內見大量內分泌顆粒。透射電鏡×2000倍、×2500倍。

附圖3、附圖4 小鼠胰腺細胞。細胞膜結構清晰、可見細胞膜間連接，胞漿內見大量內分泌顆粒和線粒體。透射電鏡×3000倍、×4000倍。

3 討論

要想獲得最終完美的電鏡圖像，每一個步驟都會是其影響因素，因此在制作過程中不能放過任何一個細節。本實驗的取材采取了膠原酶Ⅺ灌注法，并用瓊脂預包埋的方法，成功地得到了小鼠胰島細胞的透射電鏡樣品，獲得了良好的超微結構。張旭東等[2]利用直接取材法也成功得到了胰島細胞的超薄切片，但本實驗方法的優點在于：①制成樹脂包埋塊以后無需半薄定位，直接超薄切片，避免反復定位，更快速，省去時間成本。②直接取材的方法，經常定位不準確，取不到有效區域，則需要重新取樣，反而費時費力。而本實驗可以做到精準取材，高速有效，能夠在有限的觀察視野下，看到更多的胰島細胞。而后利用瓊脂預包埋法，把相對松散又細小的胰島細胞集中在一起，更加提高了超薄切片上的有效區域，有利于實驗人員更為全面地觀察和判斷胰島細胞的超微結構。本實驗的關鍵不是瓊脂的濃度，而是瓊脂低熔點的特性，在高溫煮沸瓊脂后將溫度降至40℃時，瓊脂仍然為液體狀態，加入后與胰島細胞混合，離心，待溫度降到40℃以下時則瓊脂凝固，此時胰島細胞已經離心、團聚至瓊脂最下方。此外，瓊脂的低熔點也避免了細胞內超微結構受損。除了瓊脂低熔點的特性以外，膠原酶Ⅺ的濃度和時間也是決定獲取胰島細胞多與少的關鍵因素：如若濃度過低或時間過短，會使胰島尚未完全分離，而外分泌腺則會混入其中；若濃度過高或時間過長，則會破壞胰島包膜，消化過度。

本實驗方法中需要注意的細節有：①鋨酸進行后固定以后，帶有瓊脂的胰島細胞會顯色，被氧化成黑色，需要修掉多余的瓊脂塊，最后留少量瓊脂，以便后續的脫水和滲透。如果瓊脂濃度過高也不利于脫水和滲透。②將瓊脂加入到胰島細胞時的溫度：溫度過高容易燙損細胞，溫度過低容易使瓊脂凝固，無法離心沉淀。

綜上所述，本實驗通過膠原酶Ⅺ灌注的方法取材，后經利用低熔點瓊脂預包埋，成功制備出胰島細胞的超薄切片，可有效獲得數量較多的并且超微結構不受損傷的胰島細胞結構。在利用膠原酶Ⅺ灌注取材的時候會相對比直接取材相對更費事，但是這種方法可以在制樣后段有效地提高工作效率，并對胰島調節血糖的機制提供了可靠而有效的方法。