纖維素降解菌的篩選及酶活力條件優化研究

韓耀洋

（成都七中嘉祥外國語學校，四川 成都 610000）

世界上平均每年大約生成1 000億t植物纖維素物質，如秸稈、廢棄纖維產品等，其中僅有一小部分能夠被回收利用，其他絕大多數都采用焚燒或者填埋等手段進行處理，不僅造成資源的浪費，還會對環境產生巨大的破壞[1～3]。因此，如何有效地處理這些纖維素廢棄物已經成為熱門課題之一。木質纖維素降解菌是一類具有高效降解纖維素或堆肥發酵能力的微生物，具有無污染、成本小、速度快等優點，因此篩選出活性高、穩定性強、適用環境廣的纖維素降解菌是當前研究的重難點之一[4～7]。通過對腐殖土壤中分離篩選的高效纖維素降解菌在不同環境下的活性情況進行研究，旨在通過其在不同溫度、不同pH值條件下的活性，合理優化、構建高效的纖維素降解菌，為處理纖維素廢棄物提供參考[8，9]。

1 試驗材料與方法

1.1 菌株材料來源

試驗用纖維素降解菌來自實驗室前期篩選的菌株S2，經鑒定為木霉菌（Trichoderma sp.）。

1.2 培養基

纖維素剛果紅培養基：稱取羧甲基纖維素鈉 2 g、（NH4）2SO42 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、剛果紅0.4 g、瓊脂12 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

LB液體培養基：稱取酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，再用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

羧甲基纖維素鈉培養基：稱取羧甲基纖維素鈉10 g、 蛋 白 胨 2 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、酵母膏0.5 g和瓊脂粉10 g，加蒸餾水950 mL加熱溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min后待用。

1.3 發酵培養

將純化后的纖維素降解菌S2接種到培養基中（每250 mL錐形瓶中裝有100 mL液體培養基），于35℃恒溫搖床中175 rpm/min培養48 h。

1.4 試劑配制

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取 6.3 g DNS加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液（作為A液）中，另稱取182 g酒石酸鉀鈉加入500 mL蒸餾水中，加熱溶解（作為B液）。將A液加入B液后，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，完全溶解后定容到1 000 mL，貯存于棕色瓶中保存。

1%葡萄糖標準溶液：準確稱取烘干后的葡萄糖1 g，加蒸餾水定容到100 mL。

1.5 酶活力的檢測

取發酵培養48 h后的發酵液，4 000 rpm/min離心10 min后取上清液作為粗制酶液，經過試驗適量稀釋。取0.5 mL酶液加入試管中，加入1 mL 1%羧甲基纖維素鈉與0.5 mL PBS，于37℃水浴30 min后，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后加入5 mL蒸餾水，混勻后用分光光度計在540 nm處檢測吸光值[10]。

葡萄糖標準曲線的繪制：按表1依次加入各種試劑后，加入0.5 mL滅活后的酶液，其余步驟同上。

表1 葡萄糖標準曲線的繪制

酶活力：即為每毫升酶液在此反應條件下1 min內使底物降解生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.6 最適條件的優化

最適pH的培養：將S2分別接種到初始pH值為4、5、6、7、8、9、10 的液體培養基中，于 35 ℃恒溫搖床中175 rpm/min培養48 h，檢測酶活力。

最適培養溫度的檢測：在最適pH值的情況下，將S2分別在不同溫度下（29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃）恒溫搖床中175 rpm/min培養48 h，檢測酶活力。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線的繪制如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

由圖1可知不同葡萄糖濃度所對應的吸光值（mg/mL），公式為 y=0.024x+0.006 66(R2=0.993 05)，后續試驗可根據這個標準曲線計算出不同pH值和溫度下的葡萄糖濃度，從而計算出酶活力。

2.2 不同初始pH值對S2酶活力的影響

不同初始pH值對S2酶活力的影響如圖2所示。

圖2 不同初始pH值對S2酶活力的影響

由圖2可以看出，纖維素降解菌S2在酸性條件下（pH值=4或5）吸光值均小于0.3，酶活力較低；S2吸光值在pH值=6時吸光值達到最大值0.64，說明此時酶活力最高；而隨著初始pH值的增加，吸光值逐步降低，在pH值=10時吸光值達到最小值0.12。

2.3 不同培養溫度對S2酶活力的影響

不同培養溫度對S2酶活力的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，纖維素降解菌S2在較高和較低溫度下吸光值較低，表示酶活力較低；在33℃時吸光值達到最大值0.41，說明此時酶活力最高；隨著培養溫度的增加，吸光值逐步又降低到0.29。說明33℃是S2最佳培養溫度。

圖3 不同培養溫度對S2酶活力的影響

綜上所述，纖維素降解菌在降解功能的篩選中根據目的和階段的不同，應采用不同的培養基；而不同種屬的微生物特性不同，表現出的酶活力在不同初始pH值和培養溫度下完全不一樣。研究表明，細菌和真菌對纖維素的降解機理存在不同，細菌主要通過細胞表面酶進行降解，所以需要附著在纖維素表面進行；而真菌是直接分泌多種細胞外酶進行降解[11]。在本研究中，木霉菌S2對纖維素具有較好的降解效果，同時通過對其培養條件的優化，旨在提高其降解效果[12]。通過試驗證明，S2的最佳初始pH值為6，最佳培養溫度為33℃。