尿液蛋白標志物聯合檢測在狼瘡性腎炎中的診斷價值

王鵬，張吉才

(湖北醫藥學院附屬醫院·十堰市太和醫院檢驗科，湖北 十堰 442000 )

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種復雜全身性自身免疫性疾病，病因不明[1]，在其各種臨床表現中，腎臟受累是影響發病率和死亡率最重要的原因之一[2]。累及腎臟時SLE死亡率至少增加1.2倍[3]，而增生性狼瘡腎炎(LN)患者10年累積腎臟存活率范圍為74%～81%[4]。目前用于LN診斷的實驗室標志物缺乏區分腎臟炎癥和損傷的敏感性和特異性，且不易預測LN的活動性[5]。腎活檢是評估LN病理嚴重程度和慢性病變的金標準， 由于侵入性的操作，連續活檢在監測LN的治療中較難實施。 因此，探索用于早期診斷腎臟疾病和預測SLE中腎臟炎癥的新型生物標志物具有重要意義。尿液生物標志物是監測LN活動性的潛力候選生物標志物，其從腎臟排泄出來并易于獲得。然而，迄今鮮有已被充分驗證用于LN患者常規臨床使用的生物標志物。

最近有研究關于蛋白質組學研究已經將尿血管抑制素，血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和CXC趨化因子配體4(the chemokine C-X-C motif receptor 4,CXCL4)鑒定為LN的潛在尿生物標志物[6-8]。血管抑制素是纖溶酶原的蛋白水解片段，有研究分析顯示活動性SLE患者尿中血管抑制素水平升高，尤其是彌漫性增生性LN患者[6]。尿血管抑制素可將活動性SLE患者與非活動性SLE患者區分開來，并與SLE活動性和腎臟病理慢性指數顯著相關。VCAM-1是參與炎癥細胞和淋巴細胞運輸的粘附分子?；顒悠赟LE或LN患者血清和尿VCAM-1升高[9]。有研究[10]顯示， SLE患者尿VCAM-1水平升高，并與腎活動性和SLEDAI評分相關。CXCL4也稱為血小板因子4(PF4)，是一種有效的抗血管生成趨化因子[11]。鑒于LN患者中這三種尿蛋白標志物的數據，本研究擬展開研究，以評估這些標志物在預測SLE活動性腎臟疾病方面的表現，與傳統的SLE標志物進行比較。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組

根據2015年美國風濕病學會(ACR)分類標準診斷，于2016年5月至2017年5月從本院門診或住院患者中招募SLE的成年患者(n=227;80例非活動性SLE患者，67例活動性非腎型SLE患者，80例活動性腎型SLE患者;女性94%;年齡(39.2±13.8)歲和53例正常對照組(女性96%，需排除肝、腎損害)。采集血液(抗dsDNA，補體C3 / 4水平)及臨床表現用于評估SLE活性，收集尿樣用于血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的測定。所有活動性SLE的患者的血液和尿液樣品均在接受免疫抑制治療之前收集。同時招募一組健康受試者作為對照。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經醫院行政倫理委員會批準。

通過SLE疾病活動動指數(SLEDAI)評估SLE疾病活性，并將LN患者分為3組：非活動性SLE患者組(SLEDAI=0的患者和在其他系統中沒有被SLEDAI評估活動性的患者)、活動性非腎病SLE患者組(SLEDAI≥1和/或其他系統沒有活動性的患者，但不包括“活動性腎臟SLE”)、活動性腎病SLE患者組(腎臟SLEDAI≥5的患者)，同時設置健康人群對照組。在招募時收集的資料包括人口統計學資料和臨床特征，腎功能參數(LN的組織學類別，尿蛋白與肌酸酐比率和沉積物以及活動性腎病患者中的血清肌酐)的臨床數據， 評估SLE疾病活動性和器官損傷。 在這些患者組和對照組中比較尿蛋白標記物水平和檢測尿標記物與各種腎臟參數之間的相關性。

1.2 血清和尿蛋白標記物的測定

抗dsDNA的血清效價(歐蒙公司)，尿液中的血管抑制素、CXCL4和VCAM1的水平(R&D公司)均采用ELISA法檢測，免疫比濁法(雅培)測定血清補體水平，所有測量均重復測定，用尿肌酐對這些尿蛋白標志物的值進行標準化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究對象

共有227例SLE患者(女性94%)參與了研究。平均年齡(39.2±13.8)歲，平均SLE病程(7.3±7.0)年。80例(35%)腎活檢，67例(30%)活動性非腎病SLE，80例(35%)非活動性SLE。53名健康受試者女性96%;平均年齡(25.8±3.9)歲作為對照組。表1顯示了研究中SLE患者的臨床特征。非活動性SLE患者比其他患者年齡大，病程長。 活動性腎病SLE患者更可能具有抗La抗體，但是抗磷脂抗體陽性較少?；钚孕阅I病SLE患者的總SLEDAI顯著高于活動性非腎病SLE患者。霉酚酸酯和他克莫司在活動性腎病SLE患者中應用較多，而羥基氯喹更常用于活動性非腎病SLE患者。然而，系統性狼瘡國際診斷聯盟(SLICC)器官損傷評分在3組SLE患者中相似。

2.2 血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的尿液水平

檢測4組研究對象中血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的尿液水平，其中活動性腎病SLE患者的三種蛋白質水平均顯著高于活動性非腎病SLE患者或非活動性SLE患者和健康對照者(表2)。在非活動性SLE患者(n=80)中，有腎臟疾病史的患者(n=39)略高于沒有腎臟疾病史的患者(n=41)，血管抑制素水平分別為[(0.38±0.65)ng/ngvs. (0.31±0.48 )ng/ng，P=0.49]；CXCR4[(0.46±1.97)pg/ngvs. (0.31±1.01) pg/ng，P=0.59]；VCAM-1[(169±380)pg/ngvs. (150±337) pg/ng，P=0.63)]。 但差異沒有統計學意義。

表1 本研究中SLE患者的臨床特征

aPL抗磷脂，a抗心磷脂IgG或狼瘡抗凝血劑。

表2 研究對象中的尿蛋白標記物

a.活動性腎病與活動性非腎病SLE組的P值;b.活動性SLE與非活動性SLE組的P值。

2.3 通過ROC曲線分析

表3顯示了AUCs和最佳cut-off值。在三種尿蛋白標記物中，血管抑制素在鑒別活動性腎病與活動性非腎病SLE中顯示出最高的AUC和特異性/敏感性。另一方面，在活動性腎型和活動性非腎性SLE患者中，CXCL4和VCAM-1與常規血清學標志物(抗dsDNA和補體C3)具有相似的AUC和特異性/敏感性。在活動性SLE和非活動性SLE患者中，所有三種尿蛋白標記物與常規標記物(抗dsDNA和補體C3)相比，具有相似的AUC和特異性/靈敏度指標。

2.4 三種尿蛋白標志物對活動性與非活動性LN的診斷性能

表4顯示了三種尿蛋白標志物與血清抗dsDNA和低補體C3水平相比，在區分活動性腎型和活動性非腎型SLE,以及活動性SLE和非活動性SLE的表現。同樣，尿液血管抑素與CXCL4或VCAM-1相比，在鑒別活動性腎型和活動性非腎型SLE方面顯示出更高的特異性，敏感性，陽性和陰性預測值。后兩個標記物在區分3組SLE患者的中表現與抗dsDNA或補體C3相似。

表3 ROC分析蛋白質標記的cut-off值

表4 蛋白質標志物在的SLE患者不同區組中的表現

3 討論

本研究發現活動性腎病SLE患者尿液中的血管抑制素，CXCL4和VCAM-1的水平顯著高于活動性非腎病或非活動性SLE患者。這些尿液標志物的水平與SLE疾病活動性評分，腎病活動性評分和尿蛋白水平顯著相關。這些標記物能夠區分活動性腎臟和活動性非腎臟性SLE，以及活動性SLE和非活動性SLE。經活檢證實為活動性LN的患者中，尿CXCL4和VCAM-1與活檢活動性指數相關，但與蛋白尿無關。另一方面，尿血管抑素與蛋白尿相關，但不與活檢活性指數相關。這些觀察結果表明導致蛋白尿的致病機制和導致腎臟病理學“活動性”的組織學變化可能不相同。足狀突細胞失能可能導致蛋白尿，但不是活性指數的變化。進一步的研究有助于研究血管抑制素如何與機體蛋白尿相關，并深入了解CXCL4和VCAM-1對腎臟病理學“活動性”的特定方面的影響。

血管抑素是纖溶酶原的N-末端片段，是一種有效的血管生成抑制劑，其能特異性抑制增殖并誘導血管內皮細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長[12]。最近，血管抑制素已經顯示出通過抑制嗜中性粒細胞的活化和遷移而具有抗炎特性[13]。在慢性腎損傷的小鼠模型中，使用表達血管生成抑制素的重組腺病毒治療顯示可以延緩腎臟疾病的進展，這可能與其抗炎作用相關。血管抑制素與腎SLEDAI和組織學慢性指數顯著相關。本研究結果證實了尿血管抑制素是一種能夠區分活動性腎病和活動性非腎病SLE的標志物，具有比抗dsDNA和C3補體更高的特異性/敏感性。盡管尿血管抑制素與蛋白尿程度相關，但是我們無法證實血管生成抑制素在亞組分析中與腎組織學嚴重性或活動性相關，可能與具有不同組織學類型LN的患者樣本有限以及相當比例的患者具有混合的LN的組織學類型。

VCAM-1是免疫球蛋白家族的一員，是一種通過與位于白細胞上的整合素相互作用參與炎癥細胞聚集的粘附分子。在包括SLE和類風濕性關節炎的幾種自身免疫疾病中，可溶性VCAM-1水平升高[9,14]。這與本研究結果一致，證實了活動性LN患者尿VCAM-1水平升高，并區分活動性腎病與活動性非腎病SLE患者。

CXCL4是一種有效的抗血管生成趨化因子，通過整聯蛋白依賴性機制影響血管生成。循環CXCL4水平在系統性硬化癥患者中增加并且與心臟和肺疾病的進程相關[15]。然而，CXCL4在免疫介導的腎小球腎炎患者尿液中排泄的起源和機制仍不清楚。在目前的研究中，患有活動性SLE和LN的患者的尿CXCL4升高。盡管CXCL4對活動性腎臟疾病的識別能力并不顯著優于血管抑制素，但與腎活檢組織活性評分顯著相關。應進一步在長期縱向研究中評估CXCL4 作為LN發作和預后(腎纖維化)的潛在生物標志物。

綜上所述，本研究發現新型尿生物標志物血管抑制素，CXCL4和VCAM-1可區分患者的活動性腎臟和非腎臟SLE疾病。這些生物標志物的尿液水平與SLEDAI，腎SLEDAI和尿蛋白水平顯著相關。這些數據表明評估這三種尿蛋白標記物在LN的活動性和預后評估中有重要臨床價值。