施氮處理下入侵植物黃頂菊表觀遺傳變異與表型可塑性響應特征

田佳源，張思宇，皇甫超河，楊殿林，田秀平，王 慧*

（1.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；2.天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384；3.沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866）

黃頂菊又稱二齒黃菊，是一年生草本植物，菊科堆心菊族黃菊屬，原產南美洲[1-2]，是近十年來入侵我國華北地區的一種新型外來植物[3]。2001年在天津市和河北省被發現后，擴散迅速[4-5]。目前，外來入侵植物已經嚴重威脅入侵地生態系統功能、農業生產以及人類健康，造成巨大的經濟損失和生態后果[6-8]。大量研究表明，氣候變暖、土壤營養水平增加，均會促使外來入侵植物增強其競爭力[9-10]。王滿蓮等[11]對入侵植物紫莖澤蘭生長特性的研究認為增加營養可以提高其入侵性。周建等[12]研究發現，施氮的增加會顯著促進空心蓮子草和蓮子草的生長。

表型可塑性是指同一基因型由于環境條件的改變在表型上作出相應變化的能力，具有遺傳基礎，也能發生進化，是生物適應環境的一種方式[13]。研究發現，優越的可塑性有利于植物在不同環境中競爭，且入侵植物比本地植物的表型可塑性更強，在生長過程中更能充分利用資源，導致入侵成功[14-15]。表觀遺傳學是指基于DNA或組蛋白上的共價修飾而非基因序列改變導致的基因表達水平的變化，這種變化具有遺傳性且遺傳是可逆的[16]。植物利用基因組的表觀修飾，改變相同基因型個體的基因表達式樣，通過表型可塑性來響應環境條件的變化[17]。DNA甲基化是目前機制研究最為透徹的表觀遺傳過程，是最重要的表觀遺傳修飾方式之一[18-20]。田耀華等[21]研究發現，增施氮肥會使紫莖澤蘭的競爭能力和表型可塑性增強。Angers等[22]研究發現，環境條件能夠誘導DNA甲基化變異，且環境誘導的DNA甲基化和表觀變異有持續性和可遺傳性。

以往對氮素添加條件下黃頂菊變化的研究主要集中在其與本地或替代植物的種間競爭、生理生態變化等方面，并沒有從表觀遺傳變異與表型可塑性變化響應角度去研究其入侵性，此外，由于黃頂菊的發生時期、生長環境以及區域分布與夏玉米基本吻合，是威脅我國玉米產量的潛在“殺手”[23-25]，所以本文模擬玉米田的施氮梯度對黃頂菊進行處理，旨在明確黃頂菊在施氮處理下表觀遺傳變異與表型可塑性響應特征，為農田外來植物入侵的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

黃頂菊種子采自天津靜海，為2015年收獲的新種。試驗于2016年6—8月在農業部環境保護科研監測所試驗網室（39°15′804″N，117°08′805″E）內進行，采用1.5 m×0.8 m微區試驗設計，4個微區組成一個試驗區組，分別設置4個施氮處理：CK（0 kg·hm-2）、T1（175 kg·hm-2）、T2（275 kg·hm-2）、T3（375 kg·hm-2），每個處理設12次重復（單株），每個區組重復3次。播種前各小區基肥施用鉀肥（氯化鉀）175 kg·hm-2、磷肥（磷酸氫二銨）120 kg·hm-2，氮肥（尿素，各梯度施用50%作為基肥），黃頂菊于2016年6月1日播種，出苗后按照所保留的密度，均勻拔出多余的黃頂菊幼苗及其他雜草，在出苗后30 d追施剩余50%氮肥。

1.2 黃頂菊甲基化MSAP測定

1.2.1 黃頂菊葉片基因組DNA提取

參照Wang等[26]、全志星等[27]方法。采用改良CTAB法提取黃頂菊葉片基因組DNA，用ND 2000核酸蛋白分析儀測定DNA濃度。

1.2.2 MSAP體系建立與優化

參見全志星等[27]實驗步驟。其中所用接頭和引物序列見表1。

1.3 黃頂菊生長及光合生理指標的測定

1.3.1 生物量指標測定

于播種后90 d（2017年8月30日）進行植物生物量測定和取樣。各處理隨機選取5株，將其根、支持結構和葉分開進行生物量測定，在105℃殺青2 h后，在80℃烘72 h，電子天平（精度0.01 g）稱量，計算如下參數：葉生物量比（Leaf mass ratio，LMR，葉質量/植株總質量）、根生物量比（Root mass ratio，RMR，根質量/植株總質量）、支持結構生物量比（Supporting or?gans biomass ratio，SBR，支持結構生物量/植株總質量，支持結構為植物的主莖與長度在3 cm以的分枝的莖的總和）、根冠比（Root mass/Shoot mass Ratio，R/C，根生物量/地上部分生物量）。

表1 本研究中接頭和引物序列信息Table 1 Sequence information of adaptor and primers used in this study

1.3.2 生長指標測定

株高采用直尺進行測量。莖粗采用游標卡尺進行測量。葉面積采用LI-3000C葉面積儀測量，葉面積指數=總葉面積/土地面積。統計花序數和分枝數（此處分枝指長度在3 cm以上，具有1對以上葉片的基部分枝和分株上的分枝）。

1.3.3 SPAD值測定

采用SY-S02植物葉綠素測定儀測定。每個小區隨機選取5株黃頂菊植株，每株選擇中上部正常生長且葉位相同的兩片功能葉，進行葉綠素含量測定。

1.3.4 光合生理指標測定

利用LI-6400便攜式光合儀測定。分析不同施氮處理對凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cond）、蒸騰速率（Tr）和水分利用效率（WUE=Pn/Tr）[28]的影響。

1.3.5 表型可塑性指數的計算

表型可塑性指數即不同處理下某一變量的最大值減去其最小值再除以其最大值[29]。

1.4 數據統計與分析

利用Quantity One軟件標記出5%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中100～800 bp區間擴展出的條帶，轉化成MSAP表型的數據0/1矩陣（其中有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0）。利用POP-Gene軟件分析樣品的多樣性指數（na，ne，h，I）。

甲基化模式類型劃分：HpaⅡ和MspⅠ能識別相同的酶切位點5’-CCGG-3’，利用兩種同裂酶對5’-CCGG-3’位點胞嘧啶甲基化敏感程度的不同，切割同一個DNA樣本會產生不同的甲基化模式，具體分類情況見表2。

使用Microsoft Excel 2010整理實驗數據，利用Duncan法進行各指標的差異顯著性檢驗（α=0.05），采用Pearson相關分析法分析表型可塑性與甲基化水平的相關性。

2 結果與分析

2.1 施氮處理下黃頂菊表觀遺傳變異分析

2.1.1 黃頂菊DNA提取及甲基化MSAP條帶分析

由于MSAP技術對基因組DNA質量要求很高，本試驗提取的黃頂菊葉片DNA要確保OD260/280在1.7～1.9范圍內，且用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測時，如圖1所示，DNA條帶必須呈清晰、無降解、無雜質狀態，否則無法保證后續酶切、擴增和MSAP條帶的穩定。

本試驗在不同施氮處理下隨機選取5株黃頂菊單株，共20個樣本進行獨立重復試驗，通過篩選，從308對引物組合中選出18對擴增效果較好的引物組合進行MSAP試驗分析。利用這18對擴增條帶清晰的引物組合，共擴增出690條條帶（本研究只統計長度在100～800 bp范圍內的條帶），部分引物的MSAP圖譜如圖2所示。平均每對引物擴增出38.3條，引物序列信息和擴增條帶數如表3所示。其中，EmHM14引物組合擴增條帶數最多為69條，EgHM14引物組合擴增條帶數最少為19條。

在本試驗統計的條帶大小范圍內部分泳道的量化分析圖如圖3所示，以第一條泳道作為參照，其余泳道擴增相同分子量的條帶相似比，第7泳道與第1泳道擴增條帶數相似度最高為61.2%，而第15條泳道與其相似度最低，為46.7%。

表2 甲基化模式分類Table 2 Methylation pattern classification

圖1 黃頂菊基因組DNA提取Figure 1 Extraction of the Flaveria bidentis genomic DNA

2.1.2 引物的遺傳多樣性與貢獻率

圖2 部分黃頂菊單株MSAP檢測結果Figure 2 MSAP profile of Flaveria bidentis plants

利用POPGene軟件對樣本遺傳多樣性指標進行分析，如表4所示，18對引物觀察等位基因數na平均值為1.918 8，有效等位基因數ne平均值為0.153 9，雜合度h平均值為0.315 1，香濃多態性指數I平均值為0.473 1。多樣性指數越高則多態性位點百分比越高，由18對引物獲得的690個位點中，有596個多態性位點，占總位點數的86.38%，表明本研究篩選獲得的18對引物組合非常適用于黃頂菊表觀遺傳多樣性研究。引物組合EeHM1的多態性位點百分比最高為97.50%，且該引物的觀察等位基因數na、有效等位基因數ne、雜合度h以及香農多態性指數I均高于平均值，說明該引物對表觀遺傳多樣性貢獻率最大。引物組合EmHM20的多態性位點百分比最低為67.74%，多樣性指數偏低，說明該引物對表觀遺傳多樣性貢獻率最小。

表3 所選引物組合的序列信息及擴增條帶數Table 3 Sequence information of the selected primers and the amplified bands number

2.1.3 不同施氮處理下黃頂菊甲基化模式和甲基化水平分析

按照DNA甲基化模式類型分類，統計不同施氮處理下黃頂菊DNA甲基化水平變化情況，如表5所示，各處理下擴增條帶總數為690條，其中半甲基化（Ⅱ）和全甲基化（Ⅲ）條帶數隨施氮量的增加而增加，但是超甲基化（Ⅳ）條帶數隨施氮量的增加而減少?？偧谆瘲l帶數為72～79條，占比為10.44%～11.45%。由圖4可知，T2和T3施氮處理下各甲基化水平的變化趨勢相似，差異不顯著，但是半甲基化和總甲基化水平與CK和T1處理比較差異顯著；全甲基化水平在T1、T2和T3處理下差異不顯著，但是與CK處理差異顯著。以上結果表明，施氮梯度會對黃頂菊甲基化狀態產生影響。

圖3 部分泳道量化分析圖Figure 3 Quantitative analysis diagram of part lane

表4 引物遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis of primers

2.2 施氮處理對黃頂菊生長和光合特性的影響

2.2.1 不同施氮處理對黃頂菊生物量及其分配的影響

施氮處理明顯增加了黃頂菊植株各部分的生物量。從表6可以看出，黃頂菊的葉生物量、莖生物量、根生物量、總生物量均隨著施氮量的增加而增大，在高氮（T3）處理下達到最大值。其中葉生物量和莖生物量在低氮（T1）和正常施氮（T2）處理下差異不顯著，但是與無氮（CK）和高氮（T3）處理差異顯著（P＜0.05）；根生物量和總生物量在各施氮處理下差異顯著。與無氮（CK）處理相比，低氮（T1）、正常施氮（T2）和高氮（T3）處理下：葉生物量分別增加了16.9%、27.3%和35.8%；莖生物量分別增加了10.4%、15.6%和21.3%；根生物量分別增加了29.9%、68.5%和94.9%；總生物量分別增加了14.5%、25.1%和34.0%。

不同施氮處理下黃頂菊的生物量分配也有明顯差異。如表7所示，支持結構生物量比在正常施氮（T2）和高氮（T3）處理下差異不顯著，但是在正常施氮（T2）和高氮（T3）處理下的支持結構比顯著高于無氮（CK）和低氮（T1）處理下的支持結構比；根生物量比與根冠比在無氮（CK）和低氮（T1）處理下差異不顯著，但是無氮（CK）和低氮（T1）處理下的根生物量比與根冠比顯著低于正常施氮（T2）和高氮（T3）處理下的根生物量比與根冠比，這可能與此時植株把較多的生物量分配到根部有關?？傊?，黃頂菊的生物量隨施氮梯度的增加而增加，施氮明顯促進了黃頂菊的生長，說明農田中施氮量越高，越利于黃頂菊生長，所以黃頂菊的入侵風險越大。

表5 各施氮處理下DNA甲基化水平變化情況Table 5 The change of DNA methylation level under different nitrogen treatments

圖4 四種施氮處理下甲基化水平Figure 4 The level of methylation under four nitrogen treatments

2.2.2 不同施氮處理對黃頂菊營養生長和生殖生長的影響

施氮處理明顯改變了黃頂菊的營養生長。黃頂菊的株高、莖粗、葉面積指數和分枝數在各施氮處理下差異明顯，除分枝數外，其他指標均隨施氮量的增加而增大，在T3施氮梯度下達到最大值；黃頂菊分枝數在T2施氮梯度下達到最大值。如圖5A、圖5B、圖5C、圖5D）所示，黃頂菊株高在各施氮梯度下差異顯著（P＜0.05）；黃頂菊莖粗在CK和T1施氮梯度下差異不顯著，與T2和T3施氮梯度相比差異顯著；黃頂菊葉面積指數在T1和T2施氮梯度下差異不顯著，與CK和T3施氮梯度相比差異顯著；黃頂菊分枝數在T2和T3施氮梯度下差異不顯著，與CK和T1施氮梯度相比差異顯著。由此可知，施氮可以促進黃頂菊的營養生長，施氮越多促進效果約明顯，說明施氮量多的農田中更適合黃頂菊生長，黃頂菊的入侵風險也就越大。

表6 不同施氮處理對黃頂菊生物量的影響Table 6 Effects of different nitrogen treatments on biomass of Flaveria bidentis

施氮處理也明顯改變了黃頂菊的生殖生長，如圖5E所示，隨施氮量的增加黃頂菊的花蕾數增加，且各施氮處理下差異顯著（P＜0.05）；與CK施氮梯度相比，T1、T2和T3施氮處理下花蕾數分別增加了116.2%、195.1%和214.7%。黃頂菊結實量大，一株黃頂菊可結12萬粒種子，花蕾數的增加無疑增加了黃頂菊的種子數量，同時加大其入侵風險。所以施氮量的增加不僅促進黃頂菊的營養生長，更嚴重的是促進黃頂菊的生殖生長，增加結實量，增加入侵風險。

表7 不同施氮處理對黃頂菊生物量分配的影響Table 7 Effects of different nitrogen treatments on biomass allocation of Flaveria bidentis

圖5 不同施氮處理對黃頂菊生長特征的影響Figure 5 Effects of different nitrogen treatments on growth characteristics of Flaveria bidentis

2.2.3 不同施氮處理對黃頂菊光合特性的影響

如表8所示，黃頂菊SPAD值隨施氮梯度的增加而增大，在T3施氮梯度下達到最大值，T2處理下黃頂菊SPAD值與T1和T3處理下SPAD值差異不顯著，但是與CK處理比較差異顯著（P＜0.05）；黃頂菊凈光合速率隨施氮梯度增加而增大，但在T3施氮梯度下出現下降趨勢，且在T1和T3施氮梯度下差異不顯著，與CK和T2施氮處理差異顯著；黃頂菊蒸騰速率在各施氮處理下與黃頂菊凈光合速率變化趨勢相同；黃頂菊氣孔導度雖然也隨施氮量的增加而增加，但是只有T2施氮處理下氣孔導度和CK、T1和T3處理下差異顯著，CK、T1和T3處理下差異不顯著；黃頂菊水分利用效率在不同施氮處理下差異不顯著。

2.3 施氮處理下黃頂菊表型可塑性響應特征分析

2.3.1 不同施氮處理對黃頂菊表型可塑性指數的影響

如表9所示，本研究中，在不同施氮處理下，黃頂菊的營養生長和生殖生長指標的表型可塑性指數相對較高，其中花蕾數和葉面積指數的表型可塑性指數最高分別為0.824 7和0.666 0。另外，根生物量的表型可塑性指數也較高，為0.531 1；生物量分配指標和光合特征指標的表型可塑性指數相對較低。由此可以看出，黃頂菊是通過調節自身的營養生長和生殖生長等指標來適應施氮處理，通過增加根生物量來吸收土壤中的養分，從黃頂菊的各項指標的表型可塑性指數來看，黃頂菊的適應能力很強，可以很好地適應環境的變化。

2.3.2 黃頂菊各指標表型可塑性指數與表觀遺傳的相關性分析

表觀遺傳變異可能是表型可塑性形成的重要分子基礎，為研究不同氮素水平下黃頂菊DNA甲基化與表型可塑性的響應特征，本文進一步分析了各甲基化狀態與不同生理指標表型可塑性指數之間的相關性（表10）。結果表明，黃頂菊DNA半甲基化水平與花蕾數呈顯著負相關，黃頂菊全甲基化水平與株高和葉面積指數呈顯著負相關，黃頂菊總甲基化水平與根生物量呈顯著負相關，與葉生物量比呈極顯著正相關。這是由于植物可能通過在某些基因的內部或附近區域發生甲基化或去甲基化來抑制或激活這些基因的表達，從而參與植物生長發育的重要生命過程。隨不同氮素水平的變化，黃頂菊可能主要通過調節5′-CCGG-3′胞嘧啶外側發生半甲基化或內側發生全甲基化的水平，來開啟花蕾數、根生物量、株高和葉面積指數相關基因的表達；而通過整體調節5′-CC?GG-3′胞嘧啶內外側發生半甲基化和全甲基化的總甲基化水平，開啟根生物量相關基因的表達而關閉葉生物量比相關基因的表達。

表8 不同施氮處理對黃頂菊葉綠素含量和光合性狀的影響Table 8 Effects of different nitrogen treatments on chlorophyll content and photosynthetic characteristics of Flaveria bidentis

表9 黃頂菊的各項指標在不同施氮處理下的表型可塑性指數Table 9 Phenotypic plasticity index of each index of Flaveria bidentis under different nitrogen treatments

表10 黃頂菊各生理指標的表型可塑性指數與甲基化水平相關性Table 10 Correlation analysis of phenotypic plasticity index and methylation level of each physiological index of Flaveria bidentis under different treatments

3 討論

外來生物入侵已成為威脅我國生態安全與生物安全的重要問題，我國每年由外來入侵物種造成的經濟損失高達2000億元[6，31]。目前，有效預防和控制外來物種的危害已經成為學術界關注的重點[32]。在以往研究入侵植物與環境的相互作用以及物種的適應性進化中，多是強調遺傳變異的作用，但事實上，植物面對環境條件的變化可以通過表型可塑性的改變來做出相應的變化從而適應環境，而基因組表觀遺傳變異是環境適應性和表型可塑性發生的機理。表型可塑性能使植物的生態幅拓寬，同時也增強了植物的耐受性，從而使植物可以在更復雜的環境下生存，使入侵種獲得競爭優勢[15，33]。

氮素是生態系統中限制植物生長、生物量和光合作用的重要環境資源之一[34]。研究表明[35]，氮素資源投入過剩會降低生態系統抵御外來植物入侵的能力，使生態系統功能面臨破壞性威脅。Gilliam[36]的研究指出，當可利用的氮素含量升高時，入侵植物會加速入侵。黃頂菊是典型的C4植物，其C4結構及其代謝途徑使它能夠適應干旱、鹽堿惡劣條件及強光條件，且具有很高的氮素利用能力[37-38]。王滿蓮等[39]研究發現，入侵植物紫莖澤蘭和飛機草對氮素添加變化表現出很高的表型可塑性，隨施氮量的增加，兩種植物的根冠比、葉生物量比、葉面積比等均升高，說明土壤含氮量的增加利于兩種植物的入侵。陸光亞等[40]研究發現，豚草的形態和生物量分配特征對氮素添加表現出很強的可塑性，且隨著施氮量的增加，株高、總生物量、支持結構生物量比等顯著增加，可知新區域中土壤含氮量增加更加方便豚草入侵。

表觀遺傳學研究顯示，生物的適應性增強往往是表型變化而不是基因型的變化[41-43]。宋欣欣等[44]和Kou等[45]利用MSAP技術，研究了低氮處理對水稻DNA甲基化的影響，結果表明水稻在低氮和無氮處理后，DNA甲基化水平降低幅度較大，降低的模式以CNG甲基化水平的降低為主。池春玉等[46]研究結果表明，低氮處理的飛機草去甲基化比例高于高氮處理的飛機草，而甲基化增強的比例又低于高氮處理。本研究也顯示T2施氮處理下獲得甲基化類型Ⅰ的帶數最多；甲基化類型Ⅱ的條帶數隨施氮量的增加而增加；類型Ⅲ的條帶數在T2施氮梯度下達到最大值。T2和T3處理下甲基化的變化趨勢相似，差異不顯著；半甲基化和總甲基化在T2和T3處理下差異不顯著但是與CK和T1處理差異顯著，說明施氮梯度會對黃頂菊甲基化狀態產生影響。

張耀鴻等[47]研究發現，外源氮輸入促進了互花米草的生長、生物量積累；Harrington等[48]研究發現，入侵植物刺檗隨著可利用氮素含量的升高，通過增加葉片氮含量和葉生物量來提高產量。與本文研究結果一致，本研究發現，黃頂菊的生長指標如葉生物量、莖生物量、根生物量、總生物量、根生物量比、根冠比、株高、莖粗、葉面積指數、分枝數和花蕾數等均隨著施氮量的增加而增加；黃頂菊的光合特征指標SPAD值、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率等均隨著施氮量的增加而增加，這說明施氮會促進黃頂菊的生長。黃頂菊在受到不同施氮處理下，各生長指標的表型可塑性指數較高，說明黃頂菊具有較強的適應能力，通過調節形態和生物量分配來適應環境，這與皇甫超河等[49]研究結果一致。

總之通過本研究，首先可以確定黃頂菊的生長指標和光合特征指標均隨著施氮量的增加而增大，施氮處理會促進黃頂菊生長，黃頂菊通過調節形態和生物量分配來適應施氮環境。其次，還可以確定黃頂菊DNA甲基化類型Ⅱ和類型Ⅲ均隨著施氮量的增加而增大，說明施氮可以改變甲基化水平和模式。為進一步明確外來入侵植物如何通過表觀遺傳來適應環境提供證據。

4 結論

施氮處理下，黃頂菊能夠通過調節自身的營養和生殖生長及根生物量分配等表型可塑性指標的變化，來適應施氮水平的變化，這種變化可能是通過在相關基因內部或附近發生甲基化或者去甲基化來抑制或激活這些基因的表達來實現的。