溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態的影響及其作用機制

林業武，陳美雄，景亞軍，李義凱，袁仕國

(1 海南省中醫院，?？?70203；2 南方醫科大學中醫藥學院)

肌筋膜痛是一種慢性肌肉疼痛，疼痛一般以肌肉上的激痛點(又稱扳機點)為中心，向周圍肌肉擴散[1]。雖然目前對扳機點現象的解釋不同，但均認為肌筋膜痛癥狀的產生起因于扳機點[2]。炎癥反應是導致機體疼痛信號產生的主要原因。有研究證實，肌筋膜痛扳機點存在明顯的炎癥反應[3]。因此，肌筋膜痛可能與扳機點炎癥反應有關。IL-6、TNF-α可通過上調環氧化酶2(COX-2)表達，使單核細胞和巨噬細胞大量合成前列腺素E2(PGE2)，從而參與機體炎性疼痛產生。傳統中醫艾灸治療肌筋膜痛可明顯緩解疼痛癥狀[4]，但其作用機制是否與扳機點組織IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等炎癥因子表達變化有關尚不清楚。2016年1月～2017年12月，本研究觀察了溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態的影響，并探討其可能的作用機制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠64只，8周齡，體質量(285.5±18.3)g，由南方醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(粵)20160041。所有大鼠分籠飼養，自由攝食、飲水，飼養環境溫度22 ℃、濕度60%。本研究符合科學和動物倫理規范，并接受南方醫科大學實驗動物倫理委員會監督。溫和灸純艾絨艾條，北京同仁堂(毫州)飲片有限責任公司。XR-PT-10A型動物實驗跑臺，上海欣軟信息科技有限公司。自制打擊器[5，6]，主要部分為長度50 cm的木棒，木棒頂端載有重物，木棒及重物總質量1 200 g，下端為鈍頭錐形，打擊面積1 cm×1 cm，打擊高度20 cm，動能2.352 J。BX-53型光學顯微鏡，日本Olympus公司；RM2235型石蠟輪轉切片機，德國Leica公司；COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體及相應二抗，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性飼養1周，隨機分為對照組24只、模型組24只、艾灸組16只。模型組與艾灸組采用打擊結合離心運動的方法[5，6]建立肌筋膜痛扳機點模型。具體方法：建模前3天，將大鼠置于動物實驗跑臺上進行適應性平坡跑，每次15 min，每天1次；建模期共8周，每周第1天進行1次打擊，打擊前用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于打擊器下方，將質量為1 200 g的打擊器從20 cm高度自由落下，打擊右下肢股內側肌中段偏上，造成股內側肌鈍挫傷；打擊次日于傾斜度為16°的動物實驗跑臺上進行持續性下坡跑訓練，速度16 m/min，持續90 min，運動中使用聲音和電刺激驅趕。艾灸組建模結束，常規飼養7天開始艾灸治療。艾灸治療方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于固定板上，點燃艾條(長20 cm，直徑7 mm)并懸空置于右股內側肌扳機點正上方20 mm，每次30 min；將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚，通過調節艾條與施灸穴位距離，保持施灸部位皮膚溫度(46±1)℃，每天1次，連續7天。模型組建模結束，常規飼養7天，同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續7天。對照組正常飼養，不建模，同期同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續7天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 扳機點骨骼肌組織病理形態 對照組與模型組分別于艾灸治療前1天及治療結束3、14天，艾灸組于艾灸治療結束3、14天，隨機選取8只，10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于手術臺上，充分暴露右側股內側肌，輕輕按壓打擊部位，尋找緊張帶或收縮結節，即扳機點。對照組如無緊張帶或收縮結節，則取右下肢股內側肌相同部位組織。以扳機點為中心，切取1 cm×1 cm×1 cm軟組織塊，均分為2份。取其中1份，用生理鹽水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規HE染色，光鏡下觀察扳機點骨骼肌組織組織病理形態。

1.3.2 扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達 采用免疫組化法。取另1份扳機點組織，同法制成4 μm厚切片。切片經脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內源性過氧化酶活性；0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 7.4)熱抗原修復，自然冷卻至室溫。5% BSA封閉30 min，分別滴加兔抗大鼠COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體(稀釋比均為1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×4次，DAB顯色15 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區域呈棕黃色，陰性染色區域呈淺灰色。每張切片采用CellSens-Entry1.15軟件隨機采集5個200倍視野，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件分析COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區域平均光密度(MOD)值。以其MOD值作為COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量[6]。

2 結果

2.1 各組扳機點骨骼肌組織病理形態變化 光鏡下可見，對照組各時期扳機點肌纖維排列規則，肌間隙均勻一致，無肌纖維扭曲、斷裂、溶解和壞死現象，偶有炎癥細胞浸潤。模型組各時期扳機點肌纖維排列紊亂、斷裂、扭曲，艾灸治療前1天扳機點局部骨骼肌有溶解壞死灶；艾灸治療結束3天扳機點局部肌纖維纖維化增粗、肌間隙大小不一，并有大量炎性細胞浸潤；艾灸治療結束14天扳機點局部肌纖維扭曲形成結節，炎性細胞浸潤較艾灸治療結束3天明顯減少。艾灸組艾灸治療結束3天扳機點肌纖維排列和炎性細胞浸潤較模型組同期明顯改善，局部可見新生小血管；艾灸治療結束14天可見扳機點骨骼肌纖維排列有序，炎性細胞浸潤基本消失，但局部結節膨大尚未消失。

2.2 各組扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達比較 見表1。

表1 各組扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α

注：與同組治療結束3天比較，*P<0.05；與對照組同期比較，#P<0.05；與模型組同期比較，△P<0.05。

3 討論

肌筋膜痛是一種以存在肌筋膜扳機點為特征的局部骨骼肌疼痛綜合征，可嚴重影響患者生活質量。目前認為，肌筋膜痛癥狀的產生起因于扳機點，是造成牽涉痛、關節活動受限等的主要原因[2，7]。肌筋膜扳機點具有以下病理特征：①扳機點溫度高于正常組織；②扳機點局部區域可出現異常神經電生理改變；③扳機點局部區域循環灌注不佳，即有缺血情形；④扳機點局部區域缺氧，氧耐量和氧適應降低；⑤扳機點神經血管活性物質和某些神經遞質異常增多；⑥扳機點局部組織形態學和顯微病理學改變。雖然肌筋膜痛是非致命性疾病，但可明顯降低患者生活質量。目前對肌筋膜痛并無特效治療方法，均為對癥治療，臨床以非甾體類止痛藥較為常見，雖可在一定程度上緩解疼痛，但長期服用胃腸道不良反應較多。近年來中醫艾灸治療肌筋膜痛取得了一定進展。溫和灸是中醫艾灸中最為常用的艾灸方法，具有簡、便、驗、廉及患者接受程度高等優點。雖然溫和灸可用于治療肌筋膜痛，但對其作用機制尚不清楚。故本研究選擇中醫艾灸最為代表性的溫和灸作為干預方法，采用中醫“以痛為腧”取穴法取扳機點作為干預部位，探討了溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態的影響及其可能的作用機制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學依據。

研究發現，人體肌肉損傷后會出現IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增多[8～11]。IL-6作為一種重要的致炎因子，可刺激炎性細胞聚集、激活，并能促進炎性介質釋放[12]。血清IL-6水平增加可誘導COX-2高表達，使單核細胞和巨噬細胞大量合成PGE2，從而產生廣泛而持久的血管擴張和致痛作用，在痛覺過敏形成中具有重要作用。有研究報道，COX-2與扳機點局部病理特征和疼痛密切相關。正常情況下，機體內COX-2水平相對恒定，但在炎癥反應過程中其水平明顯升高，繼而使單核細胞和巨噬細胞大量合成PGE2。TNF-α作為一種重要的促炎介質，主要由單核巨噬細胞產生，在急性炎癥反應過程中發揮關鍵性作用[13]。IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等形成復雜的炎癥因子網絡，參與扳機點炎癥反應過程。

本研究結果顯示，模型組扳機點局部肌纖維出現扭曲、斷裂、溶解和壞死灶，早期出現大量炎性細胞浸潤；艾灸組經艾灸干預扳機點局部肌纖維排列紊亂明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減輕，尤其是在艾灸治療結束14天，其組織病理學表現已與對照組接近，但尚未完全恢復正常。本研究還發現，模型組各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯高于對照組同期，而艾灸組各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯低于模型組同期；艾灸組艾灸治療結束14天扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯低于治療結束3天，而模型組與對照組組內各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量變化不明顯。結果表明扳機點內存在明顯的炎癥反應，溫和灸局部干預可降低炎癥因子表達，促進局部損傷肌纖維修復。

綜上所述，溫和灸局部干預能夠促進扳機點肌纖維修復，其作用機制與降低扳機點局部炎癥細胞因子募集、減輕炎癥反應有關。