富含蘆丁的苦蕎啤酒的糖化工藝優化

卞小穩 ， 孫軍勇 ， 陸 健 *，4

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；4.宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷223800）

我國是啤酒產銷大國，但是啤酒市場同質化問題嚴重，急需開發具有典型特征的新型啤酒。蕎麥，作為一種營養豐富的粗糧作物，富含各種蛋白質、脂肪酸、維生素、礦物質、碳水化合物等營養成分。因此，它也有著“五谷之王”的美譽[1]，有廣闊的開發前景，作為釀酒原料也越來越受歡迎[2-3]。

苦蕎中富含獨特的生物活性成分——黃酮類化合物[4]，其中70%～90%為蘆丁[5]，蘆丁具有多種生理功能，如降血糖、防治糖尿??；降血脂，預防心血管疾??；清除自由基，抗氧化等[6-7]。但苦蕎中含有高活性、高耐受性的蘆丁降解酶，最適作用pH值為5.0，最適作用溫度為50℃[8]，濕熱條件下容易失活[9]，該酶能夠專一性地降解蘆丁[10]。張燕莉[2]研究發現，麥汁制備過程中蘆丁含量大幅減少，以致成品啤酒中蘆丁含量甚微，添加50%苦蕎麥芽釀造的混合啤酒以及100%苦蕎麥芽釀造的全蕎麥啤酒中蘆丁質量濃度為0.02 mg/L。本文通過預實驗，研究發現采用優化前的工藝，以30%的苦蕎添加量制備的苦蕎麥汁中蘆丁含量僅為15 mg/L，釀造的苦蕎啤酒中蘆丁質量濃度僅為0.2 mg/L，與張燕莉的研究結論一致。由預實驗研究發現，糖化階段是造成蘆丁大量損失的過程。因此，本文以苦蕎為研究對象，采用反相高效液相色譜法（HPLC）定量檢測蘆丁質量濃度，重點研究糖化工藝對蘆丁降解酶的影響，優化糖化工藝，提高麥汁中蘆丁的質量濃度，同時，確保采用高添加量的苦蕎制備的麥汁能夠正常發酵，最終釀造出富含蘆丁的苦蕎啤酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳麥麥芽由中糧麥芽（江陰）有限公司提供；苦蕎（tartary buckwheat） 2014 年收獲于甘肅；蘆丁、槲皮素標準品（純度≥98%）購自艾科公司；耐高溫α-淀粉酶購自廣州裕立寶公司。

麥芽標準粉碎機，北京德之杰啤酒技術有限責任公司；自動糖化儀，輕工部西安輕機所光電公司；WGZ-2-PJ型濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；KjeItec2300凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山課桌超聲儀器有限公司 （舒美牌）；Thermo Hypersil ODS C18 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司；日立高效液相色譜儀，日立公司；Haake落球式黏度計，Thermo公司；UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁檢測方法 蘆丁檢測方法參考文獻[11]。

1.2.2 蘆丁含量的測定 準確稱取100 mg蘆丁標準品，用甲醇定容至10 mL作為母液，然后分別配制成 25、50、100、200、400、800 mg/L 的標準溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃避光保存，待測。

苦蕎預處理：使用麥芽標準粉碎機，將苦蕎原料細粉，準確稱取2 g苦蕎粉，置具塞錐形瓶中，加入50 mL體積分數為65%的乙醇溶液，72℃浸提4 h，取上清，用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

麥汁預處理：取1 mL麥汁加入4 mL甲醇，充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

麥糟預處理：麥糟于50℃下烘至恒重，準確稱取1.00 g干麥糟，加入10 mL甲醇，72℃浸提4 h，取上清，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

1.2.3 蘆丁降解酶熱穩定性 粗酶液的制備參照文獻[12]。

蘆丁的酶解：參照徐寶才等人[13]的方法，并略作修改。準確稱取100 mg蘆丁，溶于20 mL甲醇，混勻溶解，用水稀釋5倍后作為底物使用。移取1 mL經適當稀釋的粗酶液于 50、60、70、80、90、95 ℃保溫1 h，分別加入4 mL底物液于50℃酶解3 min，加20 mL甲醇終止反應，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC測定蘆丁含量，將1 min內降解1 μmol蘆丁所需要的蘆丁降解酶的酶量定義為一個酶活力單位（U），計算蘆丁降解酶酶活，并根據式（1）測定蘆丁保留率。

式中，R為蘆丁保留率；m1為蘆丁保留量；m2為蘆丁總量。

1.2.4 糖化工藝的優化 （1）糖化過程中蘆丁降解酶滅酶工藝。優化前糖化工藝曲線如圖1所示。

圖1 優化前糖化工藝曲線Fig.1 Profiles of mashing process before optimization

糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝：將苦蕎與大麥麥芽分開投料，以蘆丁保留率為考察對象，選取滅酶溫度和滅酶時間為單因素實驗。首先，苦蕎分別于45、70、80、90℃在糊化鍋投料，并加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，保溫1 h，而后與糖化醪并醪，進行后續的糖化程序；蕎麥于80、90℃投料，分別保溫 10、20、30、40、50、60 min，而后與糖化醪并醪，進行后續的糖化程序。分別測定麥汁和麥糟中的蘆丁含量，計算蘆丁保留率。

（2）常規糖化參數的確定。以蘆丁及α-氨基氮濃度為考察對象，選取常規糖化參數苦蕎料水比、苦蕎添加量和中性蛋白酶的添加量為單因素設計實驗。 首先，分別選取料水比為 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，固定苦蕎作為輔料的添加量為 30%，糊化鍋加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，大麥麥芽料水比為 1∶4； 選取苦蕎添加量為 10%、20%、30%、40%、50%、60%，控制苦蕎料水比和大麥麥芽料水比均為1∶4，糊化鍋加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶；確定苦蕎料水比及添加量之后，選取糖化鍋中性蛋白酶的添加量為0、0.01%、0.02%、0.03%，研究中性蛋白酶的添加量對α-氨基氮含量的影響。

（3）常規麥汁理化指標。采用優化后的糖化工藝制備苦蕎麥汁，以全大麥麥芽制備的麥汁為對照樣組，分析麥汁的常規指標：麥汁濃度、濁度、色度、pH、黏度、α-氨基氮、總酸、總可溶性氮、高分子氮、中分子氮、低分子氮按照文獻[14]的方法進行檢測、總黃酮按照文獻[11]的方法進行檢測。

1.2.5 發酵 發酵實驗參照文獻[15]，釀造10°P啤酒，以全大麥芽麥汁釀造的啤酒為對照組，測定啤酒中的蘆丁和總黃酮含量。

2 結果與討論

由于苦蕎中存在高活性、高耐受性的蘆丁降解酶，能夠專一性地降解蘆丁，導致蘆丁含量大幅降低，且在糖化過程中蘆丁降解酶以粗酶液的形式存在。因此，從苦蕎中提取蘆丁降解酶粗酶液并進行酶解實驗，研究其熱穩定性。

2.1 蘆丁降解酶熱穩定性

按照1.2.3節的方法，提取蘆丁降解酶并進行酶解實驗，結果如圖2所示：隨著溫度的升高，蘆丁降解酶的活力降低，使得部分蘆丁未被降解，得以保留下來，蘆丁保留率呈上升趨勢。當溫度超過60℃時，蘆丁降解酶快速失活，蘆丁保留率增加，溫度達到70℃時，蘆丁降解酶酶活為2.27 U/mL，蘆丁保留率達到87%，隨后緩慢上升，溫度達到80℃以上時，蘆丁保留率為100%，達到穩定，此時蘆丁降解酶酶活為0.008 U/mL，被完全滅活。王改玲等人[10]研究表明，溫度大于60℃時，蘆丁降解酶開始失活，蘆丁得以較好保存，高于70℃時蘆丁保留率更高，該結論與本文的研究結果基本一致。

圖2 滅酶溫度對蘆丁降解酶酶活及蘆丁保留率的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of rutin hydrolase and the ratio of residual rutin

2.2 糖化工藝優化

2.2.1 糖化過程中蘆丁降解酶滅酶工藝 按照優化前糖化工藝制備苦蕎麥汁，麥汁中蘆丁質量濃度僅為15 mg/L。這是由于苦蕎與大麥麥芽于45℃共同投料，糖化用水pH為5.2，該工藝條件接近蘆丁降解酶的最適pH值5.0，最適溫度50℃[8]，導致蘆丁大幅減少。故將蘆丁降解酶的滅酶工藝與糖化工藝結合起來，將苦蕎與大麥麥芽分開投料，苦蕎在高溫下投料，邊糊化邊滅酶?；谇捌谔J丁降解酶的熱穩定性的研究，研究苦蕎的投料溫度以及保溫時間，確定蘆丁降解酶滅酶工藝。由圖3可以看出，投料溫度為80℃及以上時，蘆丁保留率接近100%，說明溫度高于80℃，保溫1 h，即可完全滅酶，與前期研究蘆丁降解酶的熱穩定性的結論一致。

圖3 苦蕎投料溫度對蘆丁保留率的影響Fig.3 Effect of mashing-in temperature of tartary buckwheat on the ratio of residual rutin

在確定80、90℃投料保溫1 h即可將苦蕎內的蘆丁降解酶完全滅活后，進一步分別研究80、90℃時，將蘆丁降解酶完全滅活的最短時間。圖4為80℃投料，保溫時間對蘆丁保留率的影響結果，發現保溫時間為30 min時，蘆丁保留率接近100%，說明80℃投料，保溫30 min，蘆丁降解酶即可被完全滅活。

圖4 80℃條件下保溫時間對蘆丁保留率的影響Fig.4 Effect of incubation time on the ratio of residual rutin at 80℃

苦蕎于90℃在糊化鍋投料，保溫時間對蘆丁保留率的影響結果如圖5所示。當保溫時間為10 min時，蘆丁保留率即為100%，表明蘆丁降解酶被完全滅活?？紤]到實際生產中的設備周轉問題，綜合考慮采用高溫短時的滅酶方式，最終確定苦蕎于90℃投料，保溫10 min，進行滅酶。糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝為：苦蕎與大麥麥芽分開投料，苦蕎于90℃在糊化鍋投料，保溫10 min，加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，大麥麥芽于45℃在糖化鍋投料，保溫30 min后并醪，進行后續的糖化程序。

圖5 90℃保溫時間對蘆丁保留率的影響Fig.5 Effect of incubation time on the ratio of residual rutin at 90℃

2.2.2 常規糖化參數的確定 確定蘆丁降解酶的滅酶工藝之后，對常規糖化參數進行研究。單因素實驗結果（圖6）顯示當料水比為1∶6時，蘆丁質量濃度達到峰值608 mg/L，故選取苦蕎料水比為1∶6，此時12°P麥汁苦蕎麥汁中α-氨基氮的質量濃度為179 mg/L，基本滿足發酵需求[16]，為了使數據具有可比性，本文蘆丁、α-氨基氮質量濃度均歸一化為12°P麥汁濃度時的含量；隨著苦蕎添加量的增加，蘆丁質量濃度逐漸增加，α-氨基氮逐漸下降，兼顧蘆丁質量濃度以及啤酒發酵所需氮源的要求，最終確定苦蕎添加量為40%，料水比為1∶6。

圖6 苦蕎料水比及添加量對麥汁中蘆丁及α-氨基氮質量濃度的影響Fig.6 Effect of the ratio of tartary buckwheat to water and the added ratio of tartary buckwheat on the contents of rutin and α-amino acid nitrogen in wort

苦蕎在90℃下投料，因不經過蛋白質休止階段，麥汁中的α-氨基氮質量濃度可能會偏低。由圖6可知，采用40%的苦蕎添加量制備的12°P麥汁中α-氨基氮為170 mg/L，略低于180 mg/L。所以，在確定蕎麥料水比及輔料比之后，研究中性蛋白酶的添加量對α-氨基氮含量的影響。由圖7可以看出，當中性蛋白酶添加量質量分數為0.01%時，麥汁中α-氨基氮質量濃度為183 mg/L，滿足發酵需求，所以確定中性蛋白酶的添加量為0.01%。

綜上所述，優化后的糖化工藝曲線如圖8所示。

圖8 優化后的糖化工藝曲線Fig.8 Profiles of mashing process after optimization

2.2.3 麥汁理化指標分析 采用優化后的糖化工藝制備苦蕎麥汁，并以全大麥麥芽汁為對照樣品，對常規理化指標的分析結果如表1所示。加入40%的苦蕎使得麥汁濃度、濁度、總酸及α-氨基氮降低，黏度增加，pH幾乎相同。與對照組相比，由于苦蕎是在90℃下投料，不經過蛋白質休止階段，苦蕎麥汁中的總可溶性氮質量濃度大幅降低，不同分子量的可溶性氮的比例有所變化，中分子可溶性氮大幅減少，高分子、低分子可溶性氮增加。但是與對照組相比，添加苦蕎的12°P麥汁中蘆丁質量濃度大幅提高，從0 mg/L增加到611 mg/L，總黃酮的質量濃度變化較大，從16 mg/L增加到650 mg/L，增加30倍。與優化前的糖化工藝制備的苦蕎麥汁相比，蘆丁的質量濃度從15 mg/L增加到611 mg/L，增加約41倍。

表1 麥汁理化指標分析表Table 1 Physical and chemical indexes of wort

2.3 啤酒中蘆丁和總黃酮的檢測

檢測實驗室條件下釀造的2種啤酒中蘆丁和總黃酮的質量濃度（見圖9）。由圖9可知，添加40%苦蕎釀造的10°P苦蕎啤酒中，蘆丁和總黃酮的質量濃度均大幅提高。隨著后酵降溫，啤酒發酵液中逐漸有蘆丁結晶析出，最終使得苦蕎麥汁中約40%的蘆丁隨著發酵進入苦蕎啤酒中，10°P苦蕎啤酒中蘆丁總量達220 mg/L，約為對照組的52倍；總黃酮的質量濃度為363 mg/L，約為對照組的10倍。與優化前的工藝釀造的苦蕎啤酒相比，蘆丁的質量濃度從0.2 mg/L增加到220 mg/L。研究表明，蘆丁的分子結構，決定了其具有清除自由基，抗氧化的功效[17]，據報道具有明顯藥理作用的蘆丁攝入量為180～350 mg/d[18]。因此，富含蘆丁的苦蕎啤酒是一種較好的攝入蘆丁的飲品。

圖9 啤酒中蘆丁和總黃酮的含量Fig.9 Contents of rutin and flavonoids in beers

3 結 語

苦蕎中含有的高活性的蘆丁降解酶在糖化過程中能夠專一性地降解蘆丁，導致麥汁中蘆丁含量降低。采用HPLC對苦蕎麥汁中的蘆丁進行定量檢測，研究蘆丁降解酶的熱穩定性，最終確定糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝，苦蕎的投料方式由45℃共同投料調整為90℃在糊化鍋進行投料，在糊化的同時，將蘆丁降解酶完全滅活。確定釀造苦蕎啤酒的最優糖化工藝：糊化鍋苦蕎投料溫度90℃，苦蕎添加量40%，料水比1∶6，耐高溫α-淀粉酶添加量8 U/g，保溫10 min；糖化鍋大麥麥芽投料溫度45℃，料水比1∶4，中性蛋白酶添加量 0.01%，保溫30 min后，并醪，進行后續糖化程序。通過對苦蕎啤酒生產工藝的優化，使得12°P麥汁中蘆丁的質量濃度從15 mg/L增加到611 mg/L，增加約41倍，其他麥汁常規理化指標與大麥麥芽麥汁差異不大，且實驗室釀造的10°P苦蕎啤酒中蘆丁質量濃度由0.2 mg/L上升到220 mg/L?？嗍w啤酒中的蘆丁及總黃酮的質量濃度大幅提高，能夠提高苦蕎啤酒的抗氧化性，下一步需要對這方面進行深入分析。