新型3D打印PLCL/Col多孔復合支架的制備及初步表征*

劉威 王猛 蔡高銳 劉黎軍 熊建義** 王大平**

（1.深圳市第二人民醫院創傷骨科，廣東深圳518035；2.深圳市組織工程重點實驗室，廣東深圳518035；3.駐馬店市第一人民醫院骨科，河南駐馬店463000）

支架作為組織工程三要素之一，在組織再生過程中發揮重要作用。制備理想的組織工程支架用于修復組織缺損、促進組織再生是當前研究熱點之一?，F有的支架成型技術的類型較多，且各有優缺點，其中三維打印技術包括低溫快速成型技術（lowtemperature deposition manufacturing,LDM），LDM因其有能精確控制支架孔徑尺寸和孔隙率的優勢，越來越多地應用于組織工程領域[1-3]。LDM是基于快速成型技術原理，結合相分離法的一種新型快速成型技術，屬于綠色制造的范圍。它與其他快速成型技術不同之處在于其成型腔內溫度被控制在0℃以下，噴頭噴出的溶液在低溫下快速凝結，并且噴頭在計算機控制下按程序運動，打印層通過層層疊加最終使支架成型為三維立體結構，最后，凍結的支架經過冷凍干燥去除溶劑后成型為三維多孔支架[3]。

聚左旋乳酸(poly L lactic acid,PLLA)、殼聚糖、I型膠原蛋白（collagen type I,Col）等已成功打印[4-6]。然而，復合材料的打印通常是將合成材料與無機納米顆?；旌虾蟠蛴崿F，如鄭雄飛等[5]以水為溶劑把殼聚糖與納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA）混合后，用LDM打印成三維復合材料支架。盡管如此，現有技術打印的三維支架仍然存在各自缺陷，合成材料如乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lacticco-glycolic acid,PLGA）與無機納米顆粒如nHA混合后雖然力學性能得以保持，并且能改善支架的親水性，但是其生物相容性卻相對天然高分子材料支架較差；天然材料如殼聚糖與無機納米顆粒如nHA復合支架生物相容性較好，但其力學性能大不如合成材料支架[3,7,8]。所以，如何能在保持力學性能良好的情況下獲得較好的生物相容性，是利用LDM打印三維多孔組織工程支架亟待解決的問題。

合成材料如左旋乳酸-己內酯共聚物（poly L lactide-co-ε-caprolactone，PLCL）具有較好的力學性能，天然高分子材料如Col具有較好的生物相容性。所以，理論上解決上述問題的方法之一就是實現合成材料與天然高分子材料的復合。有研究者嘗試采用在合成材料支架表面涂覆的方法或者天然材料填充合成材料支架的方法解決問題，取得了一定效果，但是由于各類材料的相與相之間不均一，未能實現合成材料與天然高分子材料的均一復合[8-10]。由于LDM對溶解材料的溶劑要求較為苛刻，要求溶劑在常溫下為能夠溶解材料的液態，而在溶液從噴嘴打印出，能很快轉變為凍結狀態，以保證支架成型[11]。因此，溶解材料的溶劑成為制約合成材料與天然高分子材料的均一復合的瓶頸。當前，利用LDM打印時，所選擇溶解材料的溶劑絕大多數情況下為1,4-二氧六環（1,4-dioxane，DIO），較少數情況下選擇水，然而DIO和水都難以同時溶解合成材料和天然高分子材料[7,12,13]。有鑒于此，有必要找尋新的方法，解決合成材料與天然高分子材料的均一復合問題，以使所打印支架同時具有良好力學性能和生物相容性，拓寬LDM所處理材料的范圍，擴展其應用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

PLCL購買自濟南岱罡生物工程有限公司，IV:2.5 dl/g；Col從豬皮中提取，購買于四川銘讓生物科技有限公司，分子量為300 kDa。DIO購買自上海凌峰化學試劑有限公司；六氟異丙醇（hexafluoroisopropanol,HFIP）購買自上海達瑞精細化學品有限公司。

1.2 溶液配制

以配制10 ml，溶劑HFIP比例為10%，Col含量為0.1 g的PLCL和Col混合溶液為例。取1 ml濃度為10%的HFIP Col溶液滴入9 ml DIO溶劑中，攪拌48 h后，稱量1.3 g PLCL加入過濾后的Col DIO/HFIP溶液，溶解并攪拌48 h直至PLCL完全溶解并和Col充分混合后備用。稱量1.3 g PLCL溶入10 ml DIO溶劑中，然后攪拌48 h后，配制成PLCL溶液。本實驗所配置溶液及詳細數據如表1所示。

1.3 PLCLL//Col支架制備

利用低溫快速成型系統(Tissue Form II,清華大學)的Cark軟件，設計支架的打印參數。依次連接料罐、送料管、噴頭，將溶液倒入料罐內，冰箱制冷，準備成型。待成型室溫度降至-25℃～-35℃左右，啟動溫控、數控，在軟件控制下，噴嘴軟件設置的運動軌跡及造型參數在X、Y軸上進行掃描并擠壓噴出溶液，溶液在成型室內的低溫下，迅速凝固。當第一層打印結束，成型平臺在Z軸上下降一定高度，噴嘴繼續進行打印新的一層，層層疊加形成一個三維凍結支架。成型后處于凍結狀態的支架迅速取出后放置進冷凍干燥機中72 h，去除有機溶劑，使三維多孔支架最終成型。支架規格為23.6×23.6×23.6 mm3，成型溫度在-30℃左右，噴嘴直徑0.6 mm，噴絲間距0.8 mm，掃描速度22 mm/s，噴頭速度1.0～2.0 mm/s。

1.4 支架形貌表征及孔徑測量

用Canon EOS 5D Mark III光學相機對支架拍照，進行大體觀察。將PLCL/Col試樣分別剪切成一定尺寸小方塊，用濺射儀噴金40～60 s，然后在10～15 kV的加速電壓下用型號S-450掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察三維多孔支架形貌及孔隙結構。根據SEM圖像用Image J（National Institutes of Health,USA）測量支架孔徑尺寸及打印線條直徑。

1.5 支架孔隙率檢測

采用液體取代法測定支架孔隙率。先將PLCL切成數個小長方體（n=5），測量其體積V1，再將支架置入盛有體積為V2的乙醇的量筒中，抽真空至支架不再冒出氣泡，測量此時量筒讀數為V3，則支架的孔隙率ρ(%)=(V1+V2-V3)/V1×100%。同法測量PLCL/Col復合支架的孔隙率。

表1 配置溶液中溶劑和溶質含量比例（以10 ml溶液為例）

1.6 支架的收縮率檢測

用直尺測量成型支架的高、長和寬的尺寸，然后與設定參數比較，分別計算支架的高、長和寬的收縮率，每組樣品數量為4個。

1.7 支架紅外光譜測試

將樣品用型號為VERTEX 70的紅外光譜儀對其進行紅外光譜儀測試分析；分辨率為4 cm-1，掃描時間為16 s，測試波長范圍在600～4000 cm-1。

1.8 支架力學性能觀測

對支架的側面進行擠壓和對垂直面進行按壓，觀測支架的力學性能和回彈能力。用Canon EOS 5D Mark III光學相機進行拍照，記錄觀測過程。擠壓時間和按壓時間均為10 s。

1.9 統計學方法

采用Origin 9(Origin Lab Lnc,USA)軟件進行統計學分析，計量資料以均值±標準差表示；組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 支架打印

常溫下，支架取出后一段時間內能夠保持完整的結構和形態，不會快速的融化。由于支架內DIO凍結，支架呈現乳白色；支架的孔隙規則，結構清晰（圖1）。實驗過程中發現過高比例的HFIP不利于支架的成型。當HFIP的體積比例超過15%時，在成型腔內成型的凍結支架取出后會迅速融化，導致冷凍干燥步驟難以進行。這是由于HFIP在-30℃左右難以凍結，而在常溫下會迅速揮發。所以本實驗中，HFIP的比例控制在10%以下，以保證支架的成型。

2.2 支架外觀和收縮率

冷凍干燥后最終成型的PLCL/Col和PLCL支架，從垂直面均能觀察到支架上打印線條呈連續狀態，未出現斷絲等現象。此外，3種支架均呈現較清晰的孔隙和規則的孔隙結構。從側面觀察，支架呈現良好的三維立體結構，和計算機軟件設計的模型形態一致。PLCL/Col-10支架有些許變形（圖2A1）。這可能是兩個原因導致。一是支架材料中含有合成彈性材料PLCL，其加工成支架后由于本身材料學性能，會導致支架收縮；二是受HFIP溶劑的影響，由于其沒有被凍結，易揮發，所以支架在成型腔成型至冷凍干燥成型過程中，會導致支架的結構受到影響，導致其最終變形。

圖1 成型后的凍結PLCL/Col復合支架光鏡圖

各支架的高、長和寬的收縮率都在20%左右。其中PLCL支架的寬和高的收縮率與其他組相比都是最高。表2的數據進一步顯示，PLCL/Col-5支架的高的收縮率較其他組低，而PLCL/Col-10的長和寬的收縮率較其他組低。上述結果表明膠原蛋白的加入有利于降低支架的收縮率。

2.3 支架微觀形貌和孔徑檢測

圖2 冷凍干燥后最終成型的PLCL/Col和PLCL支架光鏡圖

表2 支架的高、長和寬收縮比例比較

圖3A、E和I示，支架的一級孔隙分布均勻，呈現圓形或者橢圓形，孔的大小尺寸也較均一；此外，LDM打印的線條連續，沒有斷裂，而且各條線的粗細也較均勻。通過圖3B、F和J進一步觀察，進一步證實了一級孔隙較規則，線條和線條之間粘結緊密。圖3 C、G和K觀察到線條被呈現中間細，兩頭粗的現象，但并未觀察到線條的斷裂。圖3D、H和L是支架線條的高倍SEM圖，從圖中可以觀察到各支架的次級孔隙較多，并且呈現相互貫通，孔壁光滑，孔隙間也未觀察到有顆粒狀的物質存在，表明Col的粒度較小，并且與PLCL混合均勻。通過上述結果發現，LDM打印的支架不但具有相互連通的一級孔隙，還有微米級的次級孔隙。通過SEM圖可觀察到，支架的孔隙、孔隙結構和孔徑大小均存在差異。通過測量支架孔徑尺寸發現水平面的孔徑尺寸更大，形貌和結構相對更加規則。支架在成型腔內成型后，冷凍干燥過程中，由于材料本身的性質，會存在收縮現象，這可能導致原本為規則方形的孔隙變成橢圓形或者方形。

統計復合材料支架的孔徑尺寸發現，支架的一級孔徑尺寸為 422～795 μm。PLCL/Col-5 和 PLCL/Col-10支架一級孔徑尺寸相對PLCL組均較均一，它們的一級孔徑均顯著小于PLCL組（P＜0.05）。3組支架的次級孔徑為2～25 μm，其中PLCL/Col-5的次級孔隙孔徑尺寸顯著小于其他組（P＜0.05）。PLCL支架的打印線條尺寸為（424±65）μm，顯著大于復合支架組（P＜0.05）。打印支架有較高的孔隙率，均在85%左右。PLCL/Col-5的孔隙率為86.5%±3.6%，顯著高于其他組（P＜0.05，表3）。

2.4 支架的組分檢測

圖3 LDM打印支架水平面SEM圖

為檢測支架的組成成分，證實膠原蛋白已經復合進支架內，如圖4所示，分別對PLCL支架、Col原料和PLCL/Col-10支架分別進行紅外光譜檢測。圖4 A為PLCL支架的紅外光譜圖，1755 cm-1和1734 cm-1為PLCL酯基的伸縮振動峰；1455 cm-1為CH3的C-H非對稱與對稱彎曲振動峰；1087 cm-1主要是C-C骨架的振動特征吸收峰。圖4 B為Col的紅外光譜圖，在1630cm-1和1549cm-1處分別為為膠原蛋白的酰胺I的C=O伸縮振動吸收峰和酰胺II的N-H特征吸收峰。在圖4 C中除了能觀察到PLCL在1755 cm-1、1734 cm-1和1455cm-1附近的特征吸收峰外，還觀察到在1632cm-1和1550 cm-1處有Col的酰胺I和酰胺II的特征吸收峰。上述結果表明支架中膠原蛋白的存在，證實了PLCL/Col-10支架為復合材料支架。

2.5 支架的力學性能初步觀測

在組織工程中，支架不但對細胞的黏附遷移行為具有重要的影響，還為新生組織提供支撐[14,15]。支架具有與周圍組織匹配的力學性能是支架達到理想組織工程支架的標志之一[16]。為了觀測支架的力學性能和形狀恢復能力，如圖5所示，分別對支架進行水平擠壓測試和垂直壓縮測試。如圖5 A1-A3所示，所打印支架通過水平擠壓10 s后，沒有破碎，并且能快速的回復原先形狀和尺寸。如圖5 B1-B3的光鏡圖所示，在垂直方向施壓10 s后，當力撤掉，支架迅速恢復原狀，并保持原本的形態和結構。上述結果表明所打印的3D多孔支架具有良好的力學性能和回彈能力。

3 討論

單一類型材料不能滿足軟骨組織工程用于細胞外支架材料的要求，通過一定的方法將幾種單一材料復合來增強力學強度、改善降解時間、增加生物活性是目前研究的前沿和熱點[17-20]。人工合成高分子材料具有較好的力學性能夠，但是其生物相容性較低和降解產物多呈酸性；天然高分子材料生物相容性好，來源廣泛，但存在力學性能差的問題。故此實現不同材料的復合，能有效的揚長避短，以制備性能接近理想組織工程支架的支架。

膠原是軟骨組織的主要胞外基質成分，來源廣泛，具有良好的生物相容性。在支架中加入膠原，能很好的提高支架的親水性和生物相容性，因此支架材料利用膠原具有先天的優勢。PLCL因有一定機械強度、良好的生物相容性、韌性、可降解性、無刺激性和無免疫原性等特殊性質，在軟骨與骨損傷修復中應用廣泛。更重要的是，其已經被FDA批準使用于臨床。膠原和PLCL復合材料的優越性在骨組織工程中研究已得到肯定，但國內外運用于軟骨組織工程中卻甚少。有研究者使用靜電紡絲的方法制備了PLCL和膠原復合材料支架，其體外實驗取得積極的結果[21]。但是，靜電紡絲所制備的支架存在支架孔徑尺寸較小，細胞難以長入的情況，使用此技術制備的支架更適用于覆膜。

表3 支架的孔徑尺寸、打印線條尺寸和孔隙率比較（±s）

表3 支架的孔徑尺寸、打印線條尺寸和孔隙率比較（±s）

注：與PLCL組比較，△P＜0.05；與PLCL/Col-10組比較，▲P＜0.05

支架PLCL PLCL/Col-5 PLCL/Col-10線條直徑（μm）424±65 154±4△227±49△一級孔徑（μm）696±99 581±42△485±63△次級孔徑（μm）15±6 5±3△▲16±9孔隙率（%）84.2±2.0 86.5±3.6△▲83.3±1.9

圖4 LDM打印支架及Col原料紅外光譜圖

近年來，隨著快速成型（3D打?。┘夹g的發展，通過計算機的設計，可以使用打印機實現支架孔徑尺寸的精確控制和復雜組織器官的打印[22]。LDM作為一種新型的支架成型技術，具有快速成型技術優勢。而它屬于綠色制造，可以在溫和的條件下處理材料，不損傷材料的性能[10,23]。在LDM打印支架過程中，存在著因溶劑所選范圍較小而使其難以打印天然高分子材料和人工合成高分子材料的關鍵問題[3]。

圖5 支架的擠壓及回彈和垂直面下壓及回彈光鏡圖

本實驗中，新溶劑系統HFIP/DIO被用于同時溶解天然材料Col和合成材料PLCL，配置的溶液成功被LDM打印成型。這種新型的溶劑系統，可以用于溶解多種蛋白類天然材料和合成材料，拓寬了LDM能處理材料的范圍和應用。所打印的新型PLCL/Col復合支架，通過初步的形貌表征證實具有規則的相互連通的一級大孔隙，此外組成支架的線條內還有相互連通的微米級的次級孔隙。這些孔隙的存在，將有利于營養的輸送和廢物的排除，更對細胞的黏附、遷移和增殖具有積極的影響。通過紅外光譜檢測證實Col的存在，證實所打印支架為復合材料支架。更重要的是，初步的力學觀測表明所打印符合支架具有良好的力學性能和形變恢復能力。本實驗所打印的支架在組織工程中有具有良好的應用前景。